超薄切片

在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術(shù)是*基本、*常用的制備技術(shù)。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似，需要經(jīng)過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。

取材的基本要求

組織從生物活體取下以后，如果不立即進(jìn)行適當(dāng)處理，會由于細(xì)胞內(nèi)部各種酶的作用，出現(xiàn)細(xì)胞自溶現(xiàn)象。此外，還可能由于污染，微生物在組織內(nèi)繁殖使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)遭受破壞。因此，為了使細(xì)胞結(jié)構(gòu)盡可能保持生活時的狀態(tài)，*好是在動物血流未斷之前進(jìn)行，取材時必須要做到快、小、準(zhǔn)、冷等四大要點(diǎn)：

快：即取材動作迅速，組織從活體取下后應(yīng)在*短時間內(nèi) (爭取在1分鐘內(nèi)) 投入2.5%戊二醛固定液。

?。核〗M織的體積要小，一般不超過1mm×1mm×1mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長條形。因?yàn)楣潭▌┑臐B透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定，從而影響細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的保存。

冷：所用的固定液、操作工具要預(yù)先冷藏，操作時環(huán)境溫度*好在低溫(0℃～4℃)下進(jìn)行，以降低酶的活性，防止細(xì)胞自溶。

準(zhǔn)：取材部位要準(zhǔn)確，即各組實(shí)驗(yàn)動物必須取材在同一臟器的同一位置，這樣才能有較可信的比較。

此外，還要避免機(jī)械損傷，解剖器械應(yīng)鋒利，在修小塊的時候*好用嶄新的剃須刀片，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓，*好采用“雙刀拉鋸法”，具體操作如下：

將取出的組織放在潔凈的蠟板上（蠟板可以用病理切片石蠟融化在培養(yǎng)皿中冷卻后即可使用），滴幾滴預(yù)冷的固定液，用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子輕輕地將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液，應(yīng)先用固定液洗幾遍，然后再切成小塊固定。

固定和脫水

固定的目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在它們原來所在的位置上。固定的方法有物理的和化學(xué)的兩大類。物理的方法系采用冰凍、干燥、微波等手段來保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)；化學(xué)的方法是用一定的化學(xué)試劑來固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)通常使用化學(xué)方法進(jìn)行固定，有時用物理-化學(xué)雙固定。

常用固定劑

四氧化鋨 (osmiumtetroxide，)是一種強(qiáng)氧化劑，與氮原子有較強(qiáng)的親和力，因而對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)成分有良好的固定作用。它還能與不飽和脂肪酸反應(yīng)使脂肪得以固定。此外，四氧化鋨還能固定脂蛋白，使生物膜結(jié)構(gòu)的主要成分磷脂蛋白穩(wěn)定。它還能與變性DNA以及核蛋白反應(yīng)，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化鋨固定劑有強(qiáng)烈的電子染色作用，用它固定的樣品圖象反差較好。鋨固定的時間一般為1-2小時。

戊二醛 (glutaraldehydeC5H8O2)，戊二醛的優(yōu)點(diǎn)是對糖原、糖蛋白、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等有較好的固定作用，對組織和細(xì)胞的穿透力比四氧化鋨強(qiáng)，還能保存某些酶的活力，長時間的固定(幾周甚至1～2個月)不會使組織變脆。缺點(diǎn)是不能保存脂肪，沒有電子染色作用，對細(xì)胞膜的顯示較差。

組織塊固定常規(guī)采用戊二醛—鋨酸雙重固定法。分預(yù)固定和后固定，中間用磷酸緩沖液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小時以上、后固定用1%鋨酸固定液固定1～2小時，pH7.2～7.4。固定完畢，用緩沖液漂洗30分鐘后進(jìn)行脫水。

為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必須事先將組織內(nèi)的水分驅(qū)除干凈，即用一種和水及包埋劑均能相混溶的液體來取代水，常用的脫水劑是乙醇和丙酮。急驟的脫水會引起細(xì)胞的收縮，因此，脫水應(yīng)梯度進(jìn)行：70% 丙酮15分鐘，80% 丙酮15分鐘，90%丙酮15分鐘，100%丙酮20分鐘(分二次進(jìn)行)。游離細(xì)胞可適當(dāng)縮短脫水時間。過度脫水不僅引起更多物質(zhì)的抽提，而且會使細(xì)胞皺縮變形、超微結(jié)構(gòu)破壞、同時引起樣品發(fā)脆，造成切片困難或無法切片。

浸透和包埋

（一）浸透

浸透就是利用包埋劑滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑，這種包埋劑在單體狀態(tài)時(聚合前)為液體，能夠滲入組織內(nèi)，當(dāng)加入某些催化劑，并經(jīng)加溫后，能聚合成固體，以便進(jìn)行超薄切片。目前常用的包埋劑是環(huán)氧樹脂(epoxyresin)。環(huán)氧樹脂是一類高分子聚合物，它的分子中含有兩種反應(yīng)基團(tuán)，即環(huán)氧基和羥基。當(dāng)加入酸酐類時，樹脂分子中的羥基能與酸酐結(jié)合，形成分子間的橫橋連接，這種起橫橋式連接作用的交聯(lián)劑叫做硬化劑，它們參與交聯(lián)反應(yīng)，并被吸收到樹脂鏈中。常用的硬化劑有十二烷基琥珀酸酐(或叫十二碳烯基丁二酸酐，簡稱DDSA)、甲基內(nèi)次甲基鄰苯二甲酸酐(或叫六甲酸酐，簡稱MNA)及順丁烯二酸酐等。當(dāng)加入胺類時，就引起末端環(huán)氧基相連，形成首尾相接的長鏈狀聚合物。這種促進(jìn)末端相接的交聯(lián)劑叫做催化劑或加速劑。常用的加速劑有2，4，6－三(二甲氨基甲基苯酚)(簡稱DMP-30)、二乙基苯胺及乙二胺等。為了改善包埋塊的切割性能，某些環(huán)氧樹脂包埋劑配方中還加有增塑劑，使包埋塊具有適當(dāng)?shù)捻g性。常用的增塑劑為鄰苯二甲酸二丁酯(簡稱DBP)。

（二）包埋操作

常規(guī)將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中，然后置烤箱烘干，在45℃(12小時)、60℃(36小時或更長)烤箱內(nèi)加溫，即可聚合硬化，形成包埋塊。

（三）包埋操作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)

1、所有試劑要防潮，*好存放在干燥器中；

2、所用器皿應(yīng)烘干；

3、配包埋劑時，每加入一種試劑要攪拌均勻；

4、包埋時動作要輕巧，防止產(chǎn)生氣泡；

5、皮膚盡量不要接觸包埋劑，以免引起皮炎；

6、盛放過包埋劑的容器要及時用丙酮清洗干凈；

7、操作過程*好在通風(fēng)柜中進(jìn)行。

超薄切片

(一) 超薄切片前的準(zhǔn)備工作

1、修塊

一般用手工對包埋塊進(jìn)行修整。將包埋塊夾在特制的夾持器上，放在解剖顯微鏡下，用鋒利的刀片先削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成錐體形。

2、半薄切片定位

利用超薄切片機(jī)切厚度為1μm-5μm的切片，稱半薄切片。將切下的片子用鑷子或小毛刷轉(zhuǎn)移到干凈的事先滴有蒸餾水的載玻片上，加溫，使切片展平，干燥后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡觀察定位。如果半薄切片做得好，比一般石蠟切片更能觀察到細(xì)微結(jié)構(gòu)，效果比石蠟切片要好一些。

半薄切片進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察的目的：

(1) 定位：通過光學(xué)顯微鏡觀察，確定所要觀察的范圍，然后保留要用電鏡觀察的部分，修去其余部分。

(2) 便于對同一組織的同一部位進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和電鏡的對比觀察。半薄切片定位以后，要對包埋塊作進(jìn)一步的修整。通常將塊的頂端修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形(*好是梯形)，每邊的長度為0.2mm～0.3mm。

3、制刀

超薄切片使用的刀有兩種：一種是玻璃刀，另一種是鉆石刀。由于玻璃刀價格便宜，使用者較多。制刀用的玻璃為硬質(zhì)玻璃，厚度為5mm～6.5mm。

玻璃刀用專用制刀機(jī)制作。制好玻璃刀后，要圍繞刀口制作一只水槽，以便使超薄切片漂浮在水面上。水槽有樹膠水槽和膠布水槽兩種。樹膠水槽有固定的形狀，可反復(fù)使用。膠布水槽是臨時用膠布或?qū)Ｓ盟芰蠗l制作的。裝好水槽后，用熔化的石蠟封固接口，防止漏水。

4、載網(wǎng)和支持膜

(1) 載網(wǎng)

電鏡中使用的載網(wǎng)有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)等，一般常用銅網(wǎng)。載網(wǎng)為圓形，直徑3mm。網(wǎng)孔的形狀有圓形、方形、單孔形等。網(wǎng)孔的數(shù)目不等，有100、200、300目等多種規(guī)格，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。

(2) 支持膜的制備

挑選并清洗好載網(wǎng)之后，要在載網(wǎng)上覆蓋一層薄膜，這層薄膜稱支持膜，厚度為10nm～20nm。對支持膜的要**透明無結(jié)構(gòu)，并能承受電子束的轟擊。常用的支持膜有火棉膠膜及聚乙烯醇縮甲醛膜(Formvar膜)，一般采用后者。

(二) 超薄切片

超薄切片需用超薄切片機(jī)進(jìn)行。根據(jù)推進(jìn)原理不同，將超薄切片機(jī)分為兩大類：一類是機(jī)械推進(jìn)式切片機(jī)，用微動螺旋和微動杠桿來提供微小推進(jìn)；另一類是熱脹冷縮式切片機(jī)，利用金屬桿熱脹或冷縮時產(chǎn)生的微小長度變化來提供推進(jìn)。

超薄切片的步驟包括：

1、安裝包埋塊；

2、安裝玻璃刀；

3、調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離；

4、調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置；

5、調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片；

6、將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。

超薄切片的染色

未經(jīng)染色的超薄切片，反差很弱。因此，要進(jìn)行染色處理，以增強(qiáng)樣品的反差。一般是用重金屬鹽與組織細(xì)胞中某些成分結(jié)合或被組織吸附來達(dá)到染色的目的。重金屬的原子對電子束形成散射，從而提高圖象的反差。常用的染色劑有醋酸鈾和檸檬酸鉛。染色方法有兩種：

（一）、組織塊染色

在脫水至70%乙醇或丙酮時，將組織塊放在用70%乙醇或丙酮配制的飽和醋酸鈾溶液中，染色時間2小時以上，或在冰箱中過夜。

（二）、切片染色

預(yù)先取一個清潔的培養(yǎng)皿，將石蠟溶解制作成蠟板，然后滴數(shù)滴染液于蠟板上，用鑷子夾住載網(wǎng)的邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿，染色10～20分鐘。載網(wǎng)從染液中取出后，必須盡快用蒸餾水清洗干凈。在染色過程中，鉛染液容易與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成碳酸鉛顆粒，而污染切片。因此，在保存和使用染液時，要盡量減少與空氣的接觸。為防止鉛沉淀污染，可在培養(yǎng)皿內(nèi)放置少許氫氧化鈉，以吸收空氣中的二氧化碳。

電鏡觀察、拍片、記錄等

做好觀察記錄，選好范圍拍片，準(zhǔn)確記錄底片號碼及相應(yīng)內(nèi)容，然后在電腦中備案。如果使用CCD系統(tǒng)，則遵照CCD操作程序進(jìn)行，并在觀察后作好圖片的拷貝或刻錄工作。