逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體屬RNA病毒，但可在受染細胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA互補鏈，此DNA單鏈可作為模板合成**條DNA鏈，**條DNA鏈可摻入細胞基因組DNA中。此病毒可利用宿主細胞的酶自行轉(zhuǎn)錄與復制，RNA可合成蛋白，再包裝病毒，RNA從胞內(nèi)釋放，成為感染性病毒，該載體可經(jīng)不同方式改變。介導過程可使病毒單拷貝基因組穩(wěn)定地進入細胞。

首先，逆轉(zhuǎn)錄病毒的繁殖必須要有適當?shù)陌b細胞系，以利于產(chǎn)生高滴度的病毒，同時還具有適當?shù)慕Y(jié)構(gòu)。如：ψ2（**代包裝細胞），PA317（**代包裝細胞），ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA（第三代包裝細胞），包裝細胞可提供逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env蛋白才能使帶有包裝信號及目的基因的病毒載體RNA進行包裝，包裝細胞只提供gag、pol和env蛋白而不產(chǎn)生具有復制能力的野生型病毒（RCR），而**代包裝細胞可產(chǎn)生 RCR，**性較差；**代包裝細胞，臨床上已廣泛應用，也未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生RCR，**性好；第三代包裝細胞更加**，第三代包裝細胞中主要區(qū)別是病毒結(jié)構(gòu)基因中env不同。

逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移的載體有如下特點：

(1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞的效率高，基因轉(zhuǎn)移率在10%-100%；

(2) 病毒基因轉(zhuǎn)移能將外源基因整合到宿主細胞基因組中外源基因能穩(wěn)定存在而不丟失；

(3) 外源基因整合的拷貝數(shù)一般只有一個；

(4) 逆轉(zhuǎn)錄病毒只選擇感染分裂細胞；

(5) 病毒可容納外源基因的DNA長度為<8Kb。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)：已切除了病毒的結(jié)構(gòu)基因gag，大部分pol和env，包括兩側(cè)的LTR，被選擇（標記）基因和目的基因插入的多聚位點所取代，同時還帶有包裝信號ψ。

可產(chǎn)生特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞系的建立

(一) 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進入包裝細胞系

從細胞質(zhì)粒中產(chǎn)生感染性病毒包括將質(zhì)粒導入包裝細胞系，可從穩(wěn)定感染細胞中選擇病毒產(chǎn)生細胞或用一個包裝細胞系暫時產(chǎn)生的病毒感染另一種有不同包裝的細胞系，從中選擇病毒的產(chǎn)生細胞。

1. 準備工作（用品）

(1) 適當?shù)陌b細胞系及培養(yǎng)液。

(2) 大多數(shù)包裝細胞系為鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可幫助被去除某些功能結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒復制，并包裝于蛋白衣殼中。

(3) 逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA常構(gòu)建成含有抗藥基因neo新霉素基因的載體。

(4) Hepes-緩沖液（HeBs）

(5) 2mol/L CaCl2

(6) 含血清及不含血清培養(yǎng)液

(7) HeBs 15%甘油（HeBs/甘油）

(8) 800mg/L（100×聚凝胺）（肝素對抗物）

(9) 10%～15%DMSO

(10) 10cm、6cm培養(yǎng)皿

(11) 24孔、6孔培養(yǎng)板

(12) 克隆環(huán)

2. 操作步驟

(1) 轉(zhuǎn)染前，10cm培養(yǎng)皿中接種大約10%～20%皿底面積的包裝細胞。

(2) 將10μg含抗藥基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32μL 2mol/L CaCl2，輕振動，加蓋30分鐘，室溫下培養(yǎng)45分鐘，直到小的、模糊的蘭色沉淀產(chǎn)生。

(3) 從包裝細胞中棄去舊液，輕輕滴入HeBs-DNA沉淀于細胞培養(yǎng)皿中心，使細胞接觸DNA20分鐘，每10分鐘輕輕搖動培養(yǎng)皿，使溶液均勻，加入10mL培養(yǎng)液，并于37℃放置4小時。

(4) 完全吸出培養(yǎng)液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包裝細胞系，需培養(yǎng)3.5分鐘，若為Q2bn包裝細胞系，需培養(yǎng)1.5分鐘，或根據(jù)不同包裝細胞選用不同時間。迅速棄去HeBs/甘油，用10mL培養(yǎng)液洗2次，加入含有血清的5ml培養(yǎng)液培養(yǎng)18～24小時。

(5) 取出培養(yǎng)液用0.45μm過濾，可獲得含有短期產(chǎn)生病毒的培養(yǎng)上清，-70℃或-80℃貯存，或立即用于其它包裝細胞系的感染。

(6) 加入10ml培養(yǎng)液于上述已感染的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)2～3天，繼續(xù)步驟10。

(7) 另一包裝細胞受感染前1：10或1：20傳代。

(8) 倒去包裝細胞的培養(yǎng)液，加入步驟5獲得的病毒。方法如下：

對于10cm培養(yǎng)皿，將0.1至1.0mL病毒貯存液稀釋至3～5mL的終體積，加入800mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養(yǎng)1小時以上。

(9) 若10cm培養(yǎng)皿加入10mL培養(yǎng)液，6mL培養(yǎng)皿中應加入4mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)2～3天。

(10) 步驟6或步驟9得到的感染細胞，2～3天后按1：10或1：20傳代，接種于選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4天，直至克隆出現(xiàn)。

(11) 用克隆環(huán)挑出分離的克隆，每個克隆接種24孔板或6孔板中的二個孔，生長至50～90%底部面積。

(12) 倒去培養(yǎng)液，換入1倍體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1～3天，收取培養(yǎng)液，馬上滴定，或者貯存于-70℃或-80℃。

(13) 繼續(xù)傳代克隆細胞直到能被冷凍或被鑒定，若病毒產(chǎn)生克隆被鑒定，10%～15%DMSO保護劑液氮凍存細胞。即產(chǎn)生病毒細胞系建立。

(二) 病毒滴度鑒定

在分離產(chǎn)生病毒的克隆后，需進行病毒滴度的測定，常用的方法是用病毒感染目的細胞，可根據(jù)載體RNA或蛋白的出現(xiàn)粗略定量分析。

1. 準備工作

(1) 病毒貯存液（步驟5所得）

(2) 目的細胞系（NIH3T3成纖維細胞）

(3) G418或其它選擇**

2. 操作步驟

(1) 目的細胞系NIH3T3細胞在感染前**按1：10至1：20接種6cm培養(yǎng)皿。

(2) 感染當日，棄去目的細胞培養(yǎng)舊液，加入含病毒的貯存液（步驟5所得），用1～2ml含0.01～0.1病毒貯存液感染6cm培養(yǎng)皿目的細胞 （或者3～5ml用于10cm培養(yǎng)皿中的細胞），加入800 mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養(yǎng)1～3小時，37℃。

(3) 加入培養(yǎng)液，稀釋聚凝胺至2 mg/L，再繼續(xù)培養(yǎng)2～3個細胞周期（NIH3T3細胞周期為2～3天）。

(4) -a，如果病毒帶有組化標記基因，如LacZ，用X-gal染色感染細胞。按步驟6計算藍色克隆的數(shù)量以得到病毒的滴度。

(4) -b，如果病毒攜帶抗藥基因，傳代細胞應選擇培養(yǎng)條件。如果抗藥基因為neo，細胞按1：10至1：20傳代，接種含有G418的兩個 10cm（或6cm）培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天。

(5) 更換培養(yǎng)液（含選擇性G418**）共培養(yǎng)7-10天，此時克隆應該非常明顯，計算克隆數(shù)。

(6) 滴度計算公式：

G418-RCFU（集落形成單位）/m=克隆數(shù)/病毒體積（mL）×復制因子X接種率

若為(4) -a中所敘，病毒攜帶LacZ，用X-gal染色細胞根據(jù)顯示的克隆數(shù)，計算病毒的滴度，其公式為：X-gal CFU/mL=X-gal陰性克隆數(shù)/病毒體積（mL）

(7) 其它方法再鑒定產(chǎn)生病毒的克隆，細胞所產(chǎn)生的病毒基因無重新排列或缺失。

3. X-gal對感染細胞的染色方法（此方法可使該病毒感染細胞著色，可用于直接測量病毒滴度）

(1) 準備工作

除以上各種實驗用品外，尚需：

① 帶有LacZ編碼病毒的轉(zhuǎn)染（或感染）的細胞；

② 固定液：0.05%戊二醛或2%多聚甲醛；

③ X-gal染液。

(2) 操作步驟

① 倒去培養(yǎng)液，向感染細胞的皿中加入固定液（6cm皿加2mL，10cm皿加5mL），加2%多聚甲醛室溫固定60分鐘，或0.05%戊二醛固定 5～15分鐘。

② 去除固定液，用PBS洗3次，**次洗滌時放置10分鐘，**和末次洗滌時則快速。

③ 加入*小體積的X-gal溶液，蓋住細胞37℃1小時或過夜，陽性細胞（病毒感染細胞）則成蘭色。

原代培養(yǎng)正常上皮細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染

通過將病毒基因轉(zhuǎn)染到上皮細胞中，使細胞可在體外無限生長，保持正常上皮細胞的特點。

(一) 準備工作

1. 產(chǎn)生病毒的細胞系，方法見上。

2. DMEM培養(yǎng)液

谷氨酰胺0.02μg/mL

胰島素0.25μg/mL

轉(zhuǎn)鐵蛋白0.12μg/mL

葡萄糖67.5μg/mL

10%小牛血清

聚凝胺1μg/mL

氫化考的松0.02μg/mL

3. 絲裂霉素C、胰酶、6cm培養(yǎng)皿

(二) 操作步驟

1. 病毒產(chǎn)生細胞系暴露于絲裂霉素C（4 mg/L）2小時，洗干凈后，胰酶消化，按5×106接種6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為DMEM。

2. 待轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)正常上皮細胞接種于鋪有以上細胞的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天。

3. 更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。

4. 取50μL培養(yǎng)上清，進行病毒滴度檢測，方法同前，9×103～7×104集落形成單位/mL可用于轉(zhuǎn)染。

5. 正常上皮原代培養(yǎng)10天后，取貼在飼養(yǎng)層細胞的上皮細胞，保留至上皮細胞數(shù)生長量足夠選擇。

6. 在上皮細胞生長2～4周內(nèi)，成活的克隆用克隆環(huán)挑出，再繼續(xù)使用三輪有限稀釋法建立單個細胞系克隆。

(三) 鑒定

按病毒所帶有的抗藥基因進行選擇培養(yǎng)篩選，或其它方法鑒定轉(zhuǎn)染細胞，方法見后。

(四) 注意事項

無論用什么方法將DNA導入細胞，暫時或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染率很大程度取決于細胞的類型。不同的細胞系對獲取外源性DNA以及表達的能力相差幾個數(shù)量級。此外，一種方法對一種培養(yǎng)細胞有效，但對另一種培養(yǎng)細胞可能無效。