原生質(zhì)體（Protoplast）：指采用機(jī)械或酶解法去掉細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。

一、原生質(zhì)體的應(yīng)用

由于沒有細(xì)胞壁，原生質(zhì)體為作物遺傳改良和植物學(xué)研究提供了極為有利的試驗(yàn)材料。原生質(zhì)體可以用于下面幾種研究。

1. 用作細(xì)胞雜交服務(wù)于作物改良

2. 用作遺傳轉(zhuǎn)化的對(duì)象

3. 研究細(xì)胞壁的發(fā)生過程

4. 篩選突變體

5. 膜的結(jié)構(gòu)、運(yùn)輸、**接受位點(diǎn)等的研究

6. 用于分離細(xì)胞器和大分子

7. 種質(zhì)資源保存

二、原生質(zhì)體分離、純化

原生質(zhì)體分離的*基本原則是保證原生質(zhì)體不受傷害及不損害它的再生能力。

1. 分離方法

（1）機(jī)械法分離：缺點(diǎn)：產(chǎn)量極低；應(yīng)用的材料受限制；操作極費(fèi)力

（2）酶法分離：Cocking*早開展這方面研究，克服了機(jī)械法分離的缺陷，可分為直接法和順序法兩種。酶法可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量原生質(zhì)體，缺點(diǎn)是：不純的酶制劑所含雜質(zhì)對(duì)原生質(zhì)體可能有不同程度的毒害作用。

2. 影響原生質(zhì)體分離的因素（酶法）

從理論上講，只要用適當(dāng)?shù)拿柑幚恚湍軓娜魏位罱M織中分離得到原生質(zhì)體。但是對(duì)于原生質(zhì)體培養(yǎng)來說，要得到活性高、能進(jìn)行分裂、形成愈傷組織、*后再生完整植株的原生質(zhì)體則受許多因素的影響。

3. 原生質(zhì)體分離時(shí)主要應(yīng)考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)間、溫度等。

（1）外植體來源：生長旺盛、生命力強(qiáng)的組織和細(xì)胞是獲得高活力原生質(zhì)體的關(guān)鍵，并影響著原生質(zhì)體的復(fù)壁、分裂、愈傷組織形成乃至植株再生。用于原生質(zhì)體分離的植物外植體有葉片、葉柄、莖尖、根、子葉、莖段、胚、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物（Suspension cultures）、原球莖、花瓣和葉表皮等。葉肉細(xì)胞是常用的材料，葉片很易獲得而且能充分供應(yīng)。取材時(shí)，一般用剛展開的幼嫩葉片。另一個(gè)分離原生質(zhì)體的常用材料是愈傷組織或懸浮細(xì)胞，采用其作材料可以避免植株生長環(huán)境的**影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細(xì)胞的年齡，處理時(shí)操作方便，無需**。選用懸浮細(xì)胞作材料時(shí)，需每隔3-5天繼代一次，培養(yǎng)一段時(shí)間使細(xì)胞處于旺盛生長狀態(tài)。一般在繼代后的第三天游離原生質(zhì)體。

（2）酶液組成和濃度

植物細(xì)胞壁由三個(gè)主要成分構(gòu)成：纖維素，壁干重的25-50%，半纖維素，平均53%，果膠質(zhì)，5%用來分離植物原生質(zhì)體的酶制劑主要有纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和離析酶等，酶解花粉母細(xì)胞和四分體小孢子時(shí)還要加入蝸牛酶。纖維素酶的作用是降解構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素，果膠酶的作用是降解連結(jié)細(xì)胞的中膠層，使細(xì)胞從組織中分開，以及細(xì)胞與細(xì)胞分開。

常用的酶制劑有：纖維素酶有Cellulase Onozuka R-10，Cellulase OnozukaRS，Cellulase。果膠酶有Pectolyase Y23，Macerozyme，Pectinase等。半纖維素酶有Rhozyme Hp-150，大多數(shù)植物分離原生質(zhì)體時(shí)，纖維素酶濃度在1%-3%，果膠酶在0.1%-1%，但也有很多例外。

（3）滲透壓：原生質(zhì)體操作需要在一定滲透壓存在下進(jìn)行，常用的配制分離原生質(zhì)體酶液的溶液以及洗滌原生質(zhì)體的溶液為CPW液，CPW鹽成分為：

KH2PO4   27.2 mg/L

KNO3        101.0 mg/L

CaCl2·2H2O     1480.0 mg/L

MgSO4·7H2O 246.0 mg/L

KI      0.16 mg/L

CuSO4·5H2O    0.025 mg/L

pH    5.8

根據(jù)滲透劑的濃度和成分可分為以下幾種培養(yǎng)基：

CPW13M：CPW鹽+13%甘露醇（mannitol）

CPW9M：CPW鹽+9%甘露醇

CPW21S：CPW鹽+21%sucrose

CPW0M：CPW鹽溶液。

多數(shù)情況下，甘露醇是常用的滲透劑，可能是由于它的鈍性及擴(kuò)散入原生質(zhì)體的速度很慢的緣故，這樣一來能保證一個(gè)穩(wěn)定的滲透壓。

（4）分離培養(yǎng)基：鈣、鎂離子很重要，有時(shí)需要**，PVP有時(shí)能增加原生質(zhì)體產(chǎn)量。分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)基用量一般為10 mg/g 組織。

（5）培養(yǎng)條件：主要的是酶處理時(shí)的溫度和pH。不同的酶需要的pH值不一樣，但pH大于6時(shí)不利于原生質(zhì)體生存。一般而言，分離原生質(zhì)體的培養(yǎng)時(shí)間與溫度成反比，可是高溫下短時(shí)間分離的原生質(zhì)體不適于培養(yǎng)，他們易發(fā)褐和破裂。但酶處理時(shí)間一般不超過24小時(shí)。一般常用溫度是23-32℃。酶處理時(shí)一般在暗處培養(yǎng)。葉片分離原生質(zhì)體可在靜置條件下進(jìn)行，懸浮細(xì)胞由于壁厚，培養(yǎng)（分離）過程中間斷低速震蕩有利于酶滲透。

（6）組織前處理：主要目的是便于原生質(zhì)體分離和促進(jìn)細(xì)胞分裂。高滲前處理；**處理 ；低溫處理；**處理與低溫處理結(jié)合使用。

3. 原生質(zhì)體的收集、純化與活力測(cè)定

經(jīng)酶解處理后，得到的混合物是一個(gè)由原生質(zhì)體、細(xì)胞團(tuán)與細(xì)胞碎片等組成的混合液，只有將雜質(zhì)和酶液去掉，使原生質(zhì)體純化，才能進(jìn)行培養(yǎng)。

（1）收集：原生質(zhì)體混合液用濾網(wǎng)（40-100 µm）去掉沒有降解的細(xì)胞及組織，收集濾液。

（2）洗滌：將網(wǎng)下物低速離心，去掉上清液,再加無酶液的CPW液懸起原生質(zhì)體，再離心，棄上清，重復(fù)幾次即可。

（3）純化：采用上浮法和下沉法兩種純化方法。上浮法是將酶解的原生質(zhì)體與蔗糖溶液（23%左右）混合，下沉法是先將原生質(zhì)體與13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液頂部，形成一個(gè)界面。兩種方法中，均在100×g 下離心5-10分鐘，會(huì)在蔗糖溶液頂部形成一條原生質(zhì)體帶。用吸管將帶輕輕地吸出來，用培養(yǎng)基懸浮離心，然后稀釋到104-105個(gè)/ml，用于培養(yǎng)。

（4）活力測(cè)定：原生質(zhì)體培養(yǎng)前通常要進(jìn)行活力檢查，以便知道其狀態(tài)是否正常。測(cè)定原生質(zhì)體活力的方法主要有觀察胞質(zhì)環(huán)流（Cytoplasmicstreaming）、測(cè)定呼吸強(qiáng)度和FDA染色，其中*常用的是FDA法。FDA是熒光素雙醋酸酯（Fluoresceindiacetate，F(xiàn)DA），常用丙酮配置成2 mg/ml 溶液，在冰箱（4°C）中保存。FDA本身沒有極性，無熒光，可以穿過細(xì)胞膜自由出入細(xì)胞，在細(xì)胞中不能積累。在活細(xì)胞中，F(xiàn)DA經(jīng)酯酶分解為熒光素，后者為具有熒光的極性物質(zhì)，不能自由出入細(xì)胞膜，從而在細(xì)胞中積累。在紫外光照射下，發(fā)出綠色熒光。相反如果是死細(xì)胞，則不會(huì)發(fā)出綠色熒光。

三、原生質(zhì)體培養(yǎng)

1. 原生質(zhì)體計(jì)數(shù)

原生質(zhì)體培養(yǎng)前必須調(diào)到一定密度，即確定每毫升培養(yǎng)基中含多少原生質(zhì)體。用CPW13M懸浮原生質(zhì)體，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算稀釋倍數(shù)，離心，去除CPW13M，用所算體積的培養(yǎng)基懸起原生質(zhì)體，用于培養(yǎng)。

2. 原生質(zhì)體培養(yǎng)

（1）液體淺層培養(yǎng)（Liquid thin layer culture）

原生質(zhì)體純化后，將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中，取少許于培養(yǎng)皿底部形成很薄的一層，封口進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）固體培養(yǎng)（Solid culture）

也叫瓊脂糖平板法（Agarose plate culture）或包埋培養(yǎng)法（Embeddingculture）。將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基后，與凝固劑（主要是瓊脂或低熔點(diǎn)瓊脂糖，LMT agarose）按一定比例混合，在培養(yǎng)皿底部形成一薄層，凝固后封口培養(yǎng)。

（3）固液雙層培養(yǎng)法（Solid over liquid culture）

此法結(jié)合液體淺層培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，在培養(yǎng)皿底部先鋪一層固體培養(yǎng)基，待凝固后再在其上進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可以被液體層中的原生質(zhì)體吸收利用，而原生質(zhì)體產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以被固體培養(yǎng)基吸收。

植板率（Plating efficiency，即形成愈傷組織的原生質(zhì)體數(shù)量占所培養(yǎng)原生質(zhì)體總數(shù)的百分比）。

3. ****

（1）細(xì)胞壁的形成：原生質(zhì)體培養(yǎng)后經(jīng)過一段時(shí)間會(huì)再生出細(xì)胞壁，原生質(zhì)體在培養(yǎng)初期仍然為圓球形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，逐漸變?yōu)闄E圓形，此時(shí)表明已經(jīng)開始再生細(xì)胞壁。不同植物原生質(zhì)體培養(yǎng)再生細(xì)胞壁所需時(shí)間不一樣，從幾小時(shí)到幾天。簡單的鑒別壁的再生的方法是用熒光增白劑（Calcofouor White），專染纖維素，在熒光燈下發(fā)出熒光。

一些因素影響壁的再生：

①碳源；

②培養(yǎng)條件——固體培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞壁再生比液體培養(yǎng)時(shí)快；

③滲透劑的種類。

（2）細(xì)胞分裂：**次分裂通常發(fā)生在培養(yǎng)后2-5天，可在黑麥中需14天。

4. 植株再生：具有再生能力的原生質(zhì)體就會(huì)不斷分裂，形成多細(xì)胞團(tuán)。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步發(fā)育成為肉眼可見的小愈傷組織（Minicallus），要及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（Differentiation medium）中，培養(yǎng)與再生過程同一般的愈傷組織培養(yǎng)。

四、影響原生質(zhì)體細(xì)胞分裂的因素

1. 物理?xiàng)l件

（1）密度: 低于一定密度不能分裂，一般培養(yǎng)密度為：5×103~5×105/ml。

（2）光：一般原生質(zhì)體首先在暗處培養(yǎng)一周利于壁形成和****。照光如何、什么時(shí)候照光、光強(qiáng)如何等，直接影響著植板率。

（3）溫度：通常22-25℃。

2. 化學(xué)因素

（1）培養(yǎng)基：即使來源于同一種基因型的原生質(zhì)體，在不同培養(yǎng)基中的再生能力也不一樣。許智宏等（1982，1984）發(fā)現(xiàn)在形成細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量上，KM5P和KM5都不如B5P培養(yǎng)基，但對(duì)細(xì)胞的持續(xù)分裂來說，KM5P和KM5又優(yōu)于B5P培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的附加物質(zhì)也會(huì)影響到原生質(zhì)體培養(yǎng)效果，如培養(yǎng)基中的**、無機(jī)鹽組成、氨基酸、有機(jī)酸等。MS鐵鹽一般對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)是有害的，50µM 較合適，因?yàn)楦哞F能降低培養(yǎng)基的pH。

常用的KM8P培養(yǎng)基含有豐富的有機(jī)成分，包括維生素、AA、有機(jī)酸、核苷酸、糖及糖醇等，已經(jīng)證實(shí)有機(jī)酸（丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸）可以提高**原生質(zhì)體的植板率。一些研究證明多胺類物質(zhì)對(duì)原生質(zhì)體發(fā)育有影響，培養(yǎng)基中添加腐胺、精胺、亞精胺及精氨酸可以促進(jìn)巴旦杏原生質(zhì)體發(fā)生分裂。生長素的使用量一定要小心確定，因?yàn)樗芤资挂号蓍L大或增加新液泡，從而使細(xì)胞破裂。

（2）滲透壓調(diào)節(jié)劑：培養(yǎng)的原生質(zhì)體隨發(fā)育進(jìn)程需要不斷降低滲透壓，以促進(jìn)細(xì)胞分裂。 原生質(zhì)體培養(yǎng)基中，以蔗糖和果糖作碳源和滲透壓穩(wěn)定劑時(shí)，細(xì)胞不能持續(xù)分裂，而用葡萄糖時(shí)，原生質(zhì)體能持續(xù)分裂并形成細(xì)胞團(tuán)?，F(xiàn)在一個(gè)趨勢(shì)是將蔗糖或葡萄糖單獨(dú)使用或與甘露醇結(jié)合作為穩(wěn)定劑，一旦糖被降解，培養(yǎng)基滲透壓降低，很利于細(xì)胞分裂。

3. 原生質(zhì)體來源 ：分離原生質(zhì)體所用外植體的生理狀態(tài)與原生質(zhì)體的質(zhì)量和其后的分裂頻率有著密切的關(guān)系。如在小麥原生質(zhì)體培養(yǎng)中，3-6月齡的懸浮細(xì)胞系分離的原生質(zhì)體分裂率比1月齡的原生質(zhì)體高。

4. 基因型：基因型與原生質(zhì)體培養(yǎng)及形態(tài)分化有一定的關(guān)系，同一植物不同基因型的原生質(zhì)體脫分化與再分化所要求的條件不一樣，造成不同品種在相同條件下的再生能力也會(huì)不同。