實驗方法原理
細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以*大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。
實驗材料
細胞
試劑、試劑盒
D-Hanks液小牛血清培養(yǎng)液青霉素鏈霉素胰蛋白酶HClNaHCO3DMSO甘油
儀器、耗材
微量加樣槍吸頭離心管凍存管槍頭膠塞移液管玻璃瓶紅血球計數(shù)板記號筆醫(yī)用橡皮膏移液槍超凈工作臺離心機恒溫水浴箱冰箱倒置相差顯微鏡培養(yǎng)箱液氮冰箱
實驗步驟
一、材料準備
1. 儀器：凈化工作臺、 離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
2. 玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。
3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。
4. 其他物品：微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。
5. 試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油。
二、細胞凍存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。
2. 取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中。
3. 離心1 000 rpm，5 min。
4. 去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的*終密度為5×106/ml～1×107/ml。
5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。
6. 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。
7. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
三、 細胞復蘇
1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
3. 離心， 1 000 rpm，5 min。
4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
