1.如何測定引物的OD值？

用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度*好稀釋到0.2-0.8之間(吸光度太高或太低會有較大的誤差)。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1ml并在1ml標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進而可以計算出母液的OD值。

舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50μL稀釋成1ml并在1ml標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。

2.怎樣溶解引物？

我們的的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100μmoL/L（即100pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH 7.5-8.0），開啟瓶蓋溶解之前*好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘 的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。

3.合成的引物應如何保存?

沒有溶解的引物非常穩(wěn)定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100μmoL/L的儲存液，分裝數(shù)份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復多次凍融會降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后進行實驗。

4.如何檢測引物的純度？

實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,<12個堿基的引物用20%的膠，12-60個堿基的引物用16%的膠，>60個堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的(有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是引物二級結(jié)構(gòu)條帶)。

5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團嗎?

沒有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時請?zhí)貏e注明，此時需收取磷酸化的費用。

6.合成的引物進行PCR反應時無目的帶，怎么辦?

PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。

1) 引物和模板是否配對，同源性有多大?

2) 引物本身是否有立體結(jié)構(gòu).

3) PCR反應用試劑是否能正常工作?

4) PCR儀是否工作正常?

5) PCR反應條件是否合適?

如果一切正常，還無法解決問題時，我們可以免費重新合成引物。

7.測定了引物的OD值后發(fā)現(xiàn)A260/A280<1.8，引物的純度合格嗎?

由于核酸在260nm附近有強吸收，而蛋白質(zhì)在280nm附近有強吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時，常用A260/A280比值來評價核酸純度(比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的引物的A260/A280比值也不同， 例如當序列中C、T堿基的含量高時，該比值會大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值來判斷引物的純度.

8.如何將兩條互補的單鏈退火形成雙鏈？

用退火緩沖液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反應？ 一般來講，20個堿基左右的2OD的引物*少可以做400次PCR反應。 15.引物在常溫下運輸，會降解嗎？ 不會降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運輸時間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會降解。 EDTA)溶解引物, 將要退火的引物等摩爾數(shù)混合，總體積不要超過500微升，加熱到95℃ 2mins，然后緩慢冷卻至室溫(低于30度)即可。退火的產(chǎn)物可以放在4度待用。

9.使用3%的Agarose凝膠電泳分析合成的引物，發(fā)現(xiàn)有很多條泳帶，為什么?

對引物進行電泳一定要使用變性PAGE電泳。由于引物是單鏈DNA，容易形成復雜的立體結(jié)構(gòu)，因此進行Agarose電泳時，容易出現(xiàn)多條泳帶，更無法用Agarose電泳進行定量了。

10.能否根據(jù)引物電泳后EB染色后條帶的亮度對合成的引物進行定量?

不能。因為EB是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA分子為單鏈，只有通過自身回折形成局部發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)或鏈間形成部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成雙螺旋的能力不同，因此染色能力不盡相同，也就不能根據(jù)EB染色帶的亮度來對合成的DNA進行定量。

11.2OD的引物可以多少做次PCR反應？

一般來講，20個堿基左右的2OD的引物*少可以做400次PCR反應。

12.引物在常溫下運輸，會降解嗎？

不會降解，干燥的引物在常溫至少可以穩(wěn)定存放二周以上。而一般的運輸時間通常都在1-3天，所以您收到的引物不會降解。

13: 合成的熒光標記探針應如何保存?

1.熒光探針必須避光保存。

2.干品請于-20℃保存。

3.強烈建議用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探針，這樣得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時間更長。通常，將探針配制成100 pmol/ul的儲備液，分裝成幾份 (避免反復凍融)，于-20℃保存。使用前，將配制好的儲備液稀釋成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩余部分于-20℃保存。

14: 進行PAGE電泳時，長度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?

1.A、G、C、T的組份不同，電泳速度不同；

2.DNA的立體結(jié)構(gòu)不同，電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時越容易發(fā)生，長鏈Oligo DNA之間差別較小。

15: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯誤，為什么?

如果測序后引物處出現(xiàn)了問題，不排除PCR錯配的可能，但更主要的原因應在合成引物本身。在引物合成過程中，除了人為將序列輸錯 (可核對合成報告單)，化學合成方法本身不可避免地會產(chǎn)生失敗序列，具體分析如下：

1.由于DNA合成是從3′→5′端一個堿基一個堿基地連接上去的，每連接上一個堿基，都需要多步化學反應 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)，我們稱之為一個循環(huán)。Coupling是上一個堿基的5′OH 與下一個堿基的3′活性部分發(fā)生偶聯(lián)反應，該反應的效率*高可達99%，即便如此，仍有1%的序列不能連接下一個堿基，這些序列在經(jīng)過Capping后脫離循環(huán)，成為缺堿基的失敗序列；

2.Capping是將沒有連接上下一個堿基的5′-OH乙酰化，阻止其進一步延伸。Capping的效率不可能達到100%，沒有被Cap的5′OH會進一步發(fā)生反應，造成中間缺堿基的失敗序列；

3.Detritylation是將上一個堿基5′OH上的保護基脫掉，準備連接下一個新堿基，脫保護的效率也很難達到100%，沒有脫保護的5′OH會跳過該循環(huán)而直接進入下一個循環(huán)，造成中間缺堿基的失敗序列；

4.在Coupling步驟中，新堿基(活性狀態(tài))在沒有與上一個堿基發(fā)生偶聯(lián)反應前發(fā)生自身連接，造成多堿基的失敗序列；

5.合成時堿基G可能會轉(zhuǎn)化成烯醇式異構(gòu)體，PCR擴增時被DNA聚合酶識別作A，發(fā)生 G到A的轉(zhuǎn)換。

上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。對40 mer以下的DNA制品，HPLC是*好的純化方法，其次是PAGE；而對40 mer以上的DNA制品PAGE純化要優(yōu)于單純的HPLC純化。所以，如您要對PCR產(chǎn)物克隆后測序，一定要選擇PAGE純化或HPLC純化的引物。

16: PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后測序發(fā)現(xiàn)，引物處的堿基有錯誤，怎么辦?

1.因為引物純度不可能是100%，因此，挑選克隆時，有可能挑選了雜質(zhì)引物擴增出的PCR產(chǎn)物的克隆。此時，請重新挑選一個克隆測序，會得到正確的結(jié)果。

2.如果挑選2 ~ 3個克隆測序情況還沒改觀，我們會免費重新合成引物。

17: 進行蛋白表達實驗數(shù)個月不成功，后經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)引物處有錯誤，怎么辦?

1.表達實驗之前一定要對DNA序列進行驗證。

2.我們可以免費重新合成引物。

3.如進行索賠時，按國際行業(yè)慣例，索賠范圍限于制品價格范圍之內(nèi)。

18: G到A的轉(zhuǎn)換。 上述各種原因產(chǎn)生的失敗序列可通過純化不同程度地得到去除。對40 怎樣才能保證Oligo DNA的正確性?

1.合成Oligo DNA時，選用高純度級制品。

2.避免使用過長的Oligo DNA，*好選用小于35 mer的合成DNA制品。

3.進行克隆實驗時，每次克隆都須進行測序驗證，以保證序列的正確性，然后再進行進一步實驗。進行蛋白表達實驗時，尤其需要注意。

19: 平端的PCR產(chǎn)物難以克隆，為什么?

由于一般的PCR用引物的5′末端都沒有磷酸基團，因此，擴增后的PCR產(chǎn)物的5′末端也沒有磷酸基團。當克隆于去磷酸化的末端平滑載體時，無法克隆進去；而當克隆于非去磷酸化的末端平滑載體時，背景會極高。此時請對PCR產(chǎn)物的5′端進行磷酸 (PO4修飾) 化處理。

20: 進行反義核酸實驗時，是否要對DNA鏈全部進行S代修飾，除了S代外，還有什么辦法可增加核酸在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性?

DNA經(jīng)S代修飾后比較穩(wěn)定，在細胞中不會被核酸酶降解。如果整條鏈全部S代，的確能增加DNA的穩(wěn)定性，但會降低其Tm值，也即降低該反義DNA與靶序列的結(jié)合效率。因此，科研人員一般采用將DNA片段兩端插入數(shù)個(通常3個)S代磷酯鍵Phosphorothioated Bonds)，這樣既能增加DNA的穩(wěn)定性，又能增加反義DNA與靶序列的結(jié)合能力。不過如果要將反義DNA注入到活的動物體內(nèi)，為增強穩(wěn)定性，還是將整條鏈S代效果更好。

2’ O-Me (2’-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。 此外，5-Me-dC由于能增強DNA雙螺旋的穩(wěn)定性，有時也被摻入到S代的反義核酸中。 RNA也阻抗核酸酶降解，可與S代DNA構(gòu)成嵌合的反義核酸，這樣既能增強反義核酸的穩(wěn)定性，又能增加其與靶序列的親和性 (2’-OMe-RNA與RNA的親和力要比DNA與RNA的親和力大很多)。

此外，5-Me-dC由于能增強DNA雙螺旋的穩(wěn)定性，有時也被摻入到S代的反義核酸中。

21: FITC、6-FAM、5-FAM標記之間有何區(qū)別?

它們皆是熒光素標記 (Fluorescein)，三者結(jié)構(gòu)間的區(qū)別如下：

從結(jié)構(gòu)圖可見，5-FAM與6-FAM互為異構(gòu)體；而FITC則在與Oligo的連接方式上(硫脲鍵) 有別于前者(酰胺鍵)，但它們的發(fā)色團均為熒光素，通常使用中沒有區(qū)別。

 

22: 淬滅基團為TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的雙標記熒光探針在使用上有什么不同?

由淬滅基團TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料組成的雙標記熒光探針常常被用作水解探針(Hydrolysis Probes)，或稱"TaqMan"探針，用于Real Time PCR實驗。由于這些淬滅染料的光譜學性質(zhì)不同(見下圖)，作為淬滅基團使用時的特點也不同，現(xiàn)說明如下：

1.TAMRA為熒光染料，在淬滅報告基團的同時，自身會在更高波長處發(fā)射熒光，此發(fā)射熒光會對報告基團的檢測造成影響，探針熒光本底 (Background)相對較高。而Eclipse及BHQ系列為非熒光染料，淬滅報告基團，但自身不發(fā)射熒光，因此，探針熒光本底低，信噪比更大，檢測靈敏度更高。

2.淬滅基團對報告基團的淬滅有賴于二者的光譜迭蓋(Overlapping),也即報告基團的熒光光譜應與淬滅基團的吸收光譜相交搭。對比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光譜，可見TAMRA的吸收光譜覆蓋范圍窄，可與之匹配的報告基團種類比較少；而Eclipse則具有更寬的吸收范圍(390 nm-625 nm)，可淬滅的報告基團種類很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；組合使用的BHQ系列染料的吸收光譜覆蓋范圍則更廣，從430 nm一直到近紅外，可淬滅的報告基團種類更多 (象Cy3、Cy5等的淬滅效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料組成一套雙標記熒光探針用于多重PCR(Multiplexing PCR)。

23: TaqMan 探針設(shè)計時應遵循哪些原則?

1.探針應位于兩引物之間；

2.探針中堿基G、C的含量應在20%～80%之間；

3.避免同種堿基成串出現(xiàn)，特別是堿基“G”；

4.堿基G不要出現(xiàn)在5’末端；

5.探針的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，應在68～70℃之間；

6.探針長度超過30個堿基時，*好把淬滅基團放在中間，以防止熒光本底過高，這時探針的3’末端應加磷酸基封阻，以防探針在PCR反應過程中延伸。

24: 何謂分子信標 (Molecular Probes)？與普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)相比，在使用上有什么特殊性？

Molecular Probes是一類特殊的雙標記探針，通常狀態(tài)下，其兩末端互補配對，形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu) (發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu))，發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)迫使分別連在兩末端的報告基團與淬滅基團緊密鄰近 (此時檢測不到熒光)，而一旦雜交到靶序列上，則報告基團與淬滅基團分開，Molecular Probes變得明亮起來，可檢測到熒光。由于發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，探針對靶序列檢測的特異性增強，相對于普通的雙標記探針 (如TaqMan探針)，Molecular Probes對SNP有更強的識別能力，能區(qū)分序列上僅相差一個堿基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP檢測。此外，Molecular Probes也應用于活體細胞內(nèi)的mRNA雜交、RNA加工、及轉(zhuǎn)錄過程的時時監(jiān)測研究等。

上海創(chuàng)賽科學儀器有限公司（Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd.），是一家致力于實驗室全套用品和設(shè)備（包括：生物、化學化工、實驗耗材、儀器設(shè)備等）的集約化供應商，竭誠為國內(nèi)各行業(yè)提供實驗產(chǎn)品。