1. 如何將不同構(gòu)型的質(zhì)粒DNA區(qū)別開？

答：由于不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移率不同，ccc DNA的泳動速度*快，通過凝膠電泳方法可將不同構(gòu)型的DNA區(qū)別開。

2.用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？

答：異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

3.用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？

答：用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。

4.在提取RNA時經(jīng)常使用異硫氰酸胍，有什么作用？

答：RNA是一種極易降解的核酸分子。高濃度強變性劑異硫氰酸胍使細(xì)胞結(jié)構(gòu)迅速被破壞，使RNA從細(xì)胞中釋放出來。同時高濃度異硫氰酸胍還使細(xì)胞內(nèi)的RNA酶失活，使釋放出的RNA不被降解。

5.蛋白印跡中封閉液的作用？

答：封閉液的作用是封閉未吸附蛋白的部位，以減少非特異性結(jié)合背景的影響。常用的封閉液有脫脂奶粉、小牛血清等。

6$DNA通常保存在什么緩沖液中？

答：采用TE緩沖液，Tris-HCl的緩沖系統(tǒng)，加入EDTA可以螯合二價金屬離子進(jìn)而抑制依賴于二價金屬離子的DNA酶的活性，對DNA起到保護(hù)作用。

7$在酶切反應(yīng)緩沖液中為什么加入BSA？

答：通過提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，對酶起保護(hù)作用。

8$簡單的克隆載體必需包括什么？

答：復(fù)制起點；選擇標(biāo)記：主要是抗性基因；多克隆位點：便于外源DNA的插入。

 

1.用酚抽提細(xì)胞DNA時，有什么作用？使蛋白質(zhì)變性。

2.在分離DNA時，要使用EDTA，為什么？ EDTA是金屬離子螯合劑，螯合二價離子，抑制核酸酶的活性。

3.在分離DNA過程中，造成DNA分子斷裂的因素有哪些？核酸酶降解；化學(xué)降解；物理剪切。

4.使用離心機(jī)應(yīng)注意什么？

首先應(yīng)該根據(jù)自己的實驗需求選擇合適的離心機(jī)和轉(zhuǎn)子以及離心管，使用離心機(jī)時的工作轉(zhuǎn)速不應(yīng)該超過離心機(jī)、轉(zhuǎn)子以及離心管的*大允許轉(zhuǎn)速。離心前注意嚴(yán)格平衡樣品。安裝轉(zhuǎn)子和轉(zhuǎn)子蓋要規(guī)范、準(zhǔn)確。離心時要留人看守，發(fā)現(xiàn)離心機(jī)異常應(yīng)立即關(guān)閉離心機(jī)。離心結(jié)束后要安放好轉(zhuǎn)子。

5.分子生物學(xué)實驗室常用的**方法有哪些？

高壓蒸汽**、干熱**、化學(xué)藥劑**、過濾**。

6.使用移液器有哪些注意事項？

垂直吸液、慢吸慢放；選擇合適的量程范圍，不能超過量程使用；選擇與移液器匹配的槍頭，安裝槍頭時不要用力太猛；移液器每日用完后，應(yīng)旋到*大刻度

7．為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩(wěn)定。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，*好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月。

8．抽提DNA去除蛋白質(zhì)時，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在*下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果*好。經(jīng)酚**次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿**次變性蛋白質(zhì)，此時一起將酚帶走。也可以在**次抽提時，將酚與氯仿混合(1:1)使用。

9．為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1(不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成)，同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

10．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa＝7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實驗時，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2＋產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應(yīng)時，不同的酶對輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。

 

1.電擊杯為什么要放在冰上？感受態(tài)細(xì)胞也要放在冰上？

感受態(tài)細(xì)胞是指細(xì)胞容易吸收外源DNA的狀態(tài)，這時的細(xì)胞壁是比較脆弱的，在實驗前該細(xì)胞是放在-80度冰箱的，如果感受態(tài)細(xì)胞的溫度驟然升高，那么細(xì)胞會膨脹破裂。冰為細(xì)胞提供了一個溫度緩慢升高的過程，所以電擊杯，感受態(tài)都要放在冰上。

2.載體的抗性基因是什么？平板上有什么？

載體的抗性基因是抗性基因bla，該基因特異性表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶，可以裂解***的β-內(nèi)酰胺環(huán)。在平板上是含有氨芐青霉素的，只有相應(yīng)的含有bla基因并能表達(dá)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的菌才能存活。從而達(dá)到有目的篩選的目的。

3.電轉(zhuǎn)與鈣轉(zhuǎn)的區(qū)別是什么？二者各有什么優(yōu)缺點？

1）電穿孔法：靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。

優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率較高

缺點：需要昂貴的儀器（電穿孔儀）；對細(xì)胞的損傷較大，每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA；每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。

2）磷酸鈣共沉淀法：磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面結(jié)合，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。

優(yōu)點：能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動物，瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

缺點：轉(zhuǎn)染效率低：進(jìn)入細(xì)胞的DNA只有１％－５％可以進(jìn)入細(xì)胞核，其中只有不到１％的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。

重復(fù)性不佳：pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時間、細(xì)胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結(jié)果產(chǎn)生影響。

4. 為什么在電轉(zhuǎn)完畢之后，要把菌加到SOC中培養(yǎng)，而不是加到LB培養(yǎng)集中培養(yǎng)？

SOC的成分中含有單糖和豐富的無機(jī)鹽離子，在LB培養(yǎng)基中含有酵母膏、蛋白胨等復(fù)雜的有機(jī)物。在剛剛轉(zhuǎn)化完的**細(xì)胞內(nèi)還沒有完整的酶系統(tǒng)，不能利用復(fù)雜的有機(jī)物，所以要加SOC。

5. 電擊時間是多少？電壓為多少？

電擊時間一般在4-6ms, 電壓是1.8KV.

6.為什么要擦干電擊杯上的水？

因為電擊杯在電轉(zhuǎn)之前是放在冰上的，上面粘上了水。如果不擦凈電擊杯上面的水會造成短路，達(dá)不到電擊轉(zhuǎn)化的效果。

7.為什么涂板培養(yǎng)之后，如果出現(xiàn)單菌落那么涂布就是成功的，而連成一片就是失敗的？

因為單菌落就是單克隆，整個菌落的**都是一個**繁殖得到的，它們的遺傳信息是相同的，這些菌要么都是陽性克隆，要么都是陰性克隆。如果連成一片之后，遺傳信息不能保證完全一致，那么就無法鑒定是陽性克隆還是陰性克隆。

8、瓊脂糖電泳如何進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA.

多數(shù)情況下你能看到三條帶，這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和線性。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時候抽提到的質(zhì)粒會有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。

9、傳統(tǒng)的質(zhì)粒提取方法步驟是什么

溶液Ⅰ：（50 mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl pH8.0,10 mmol/L EDTA）

溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH，2%SDS用前等體積混合

溶液Ⅲ ：5 mol/L KAc 溶液60ml， 11.5 ml冰醋酸，28.5 ml 去離子水。

溶液I—溶菌液：

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA：(1)螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基)在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。

溶液II－NaOH－SDS液：裂解細(xì)胞，變性DNA.

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時)受到干擾。

溶液III--3mol／L NaAc(pH4.8)溶液：使溶液回復(fù)中性，將基因組DNA、蛋白質(zhì)等沉淀。

NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。