1．了解質(zhì)粒作為載體在基因工程中的應(yīng)用。

2．熟記提取質(zhì)粒的基本原理，學(xué)習(xí)提取過(guò)程和方法。

[實(shí)驗(yàn)原理]

基因工程誕生于1973年。在這一年。斯坦福大學(xué)的S。Cohen等人將大腸桿菌的抗四環(huán)素質(zhì)粒PSC101和抗新霉素及磺胺的質(zhì)粒R6-3在體外用EcoRI進(jìn)行切割，并把他們連接在一起形成一新的重組質(zhì)粒：然后，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。結(jié)果，在含有四環(huán)素和新霉素和新霉素的平皿中，篩選出了抗四環(huán)素和新霉素的重組菌落。這是**次實(shí)現(xiàn)重組體轉(zhuǎn)化成功的例子，基因工程從此誕生。目前，基因工程已成為分子生物學(xué)的一個(gè)重要領(lǐng)域，但對(duì)其還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的公認(rèn)定義。一般認(rèn)為基因工程是指：在體外，將核酸分之（無(wú)論采取什么方法從細(xì)胞中取得）組合到任何病毒、**質(zhì)粒或其它載體系統(tǒng)（分子）中，形成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之進(jìn)入原來(lái)沒(méi)有這類分子的宿主體內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定地繁殖?；蚬こ痰?大特點(diǎn)使以重組DNA技術(shù)開辟了在短時(shí)間內(nèi)改造生物遺傳性狀的新天地。

基因工程的研究?jī)?nèi)容如下：

1． 目的基因的獲取 。

2． 克隆載體的選擇與改建。

3． 目的基因與載體的連接。

4． 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

5． 重組體的篩選。

6． 設(shè)法使目的基因?qū)崿F(xiàn)功能蛋白的表達(dá)。

基因工程的重要環(huán)節(jié)就是如何把外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞中去。外源基因自己很難進(jìn)入受體細(xì)胞中，既是進(jìn)入受體細(xì)胞中，一般也不能進(jìn)入復(fù)制和表達(dá)。這是因?yàn)槲覀兊玫降哪康幕虿粠в袕?fù)制子系統(tǒng)和表達(dá)調(diào)空系統(tǒng)，所以我們必須利用運(yùn)載工具即載體將外源基因?qū)氲绞荏w細(xì)胞中去。

質(zhì)粒就是一種*常用的載體。他是染色體以外的能自主復(fù)制的雙蓮、閉合、環(huán)狀DNA分子。廣泛存在于細(xì)胞中，在一些動(dòng)、植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒存在。作為載體的質(zhì)粒必須具備以下六個(gè)特點(diǎn)：（1）能自主復(fù)制：（2）具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，并在位點(diǎn)中插入外源基因后，不影響其復(fù)制功能：（3）具有1-2個(gè)篩選標(biāo)記：（4）分子量小，多拷貝，易于操作：（5）是非結(jié)合性質(zhì)粒即不含有結(jié)合轉(zhuǎn)移基因，在自然條件下不能從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中去：（6）轉(zhuǎn)化效率高。

本次實(shí)驗(yàn)是從大腸桿菌中提取和純化質(zhì)粒，以備進(jìn)一步研究之用，其原來(lái)如下：

從大腸桿菌中提取和純化質(zhì)粒的方法很多，但不外乎三個(gè)主要步驟即**的培養(yǎng)、**的收集和裂解、質(zhì)粒的分離和純化。

1． **的培養(yǎng)

挑單個(gè)菌落接種到適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通常以**培養(yǎng)夜的O。D600nm值來(lái)判斷**的生長(zhǎng)狀況，一般情況下，O。D600nm=0。4時(shí)，**處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：O。D600nm=0。6時(shí)**處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。由于質(zhì)粒在**內(nèi)進(jìn)行復(fù)制時(shí)，往往受到宿主的控制，因此在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期可進(jìn)入氯霉素。氯霉素可抑制**的蛋白質(zhì)生物合成和染色體DNA的復(fù)制，而質(zhì)粒的復(fù)制不受其影響而得以大量擴(kuò)增。對(duì)于新一代的質(zhì)粒如pUC質(zhì)粒系列，由于宿主對(duì)其復(fù)制控制不嚴(yán)，所以添加氯霉素已不十分必要。使用氯霉素的目的是，在不減低質(zhì)粒產(chǎn)量的前提下，減少**的培養(yǎng)體積和數(shù)量以降低**裂解物的復(fù)雜性和粘稠度。

2． **的收集和裂解

**在生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)將大量代謝物排到培養(yǎng)液中。為提高質(zhì)粒的純度，往往通過(guò)離心棄除培養(yǎng)液，在將**沉淀適當(dāng)干燥或用緩沖液漂洗1~2次，以便盡量將培養(yǎng)液去除干凈。

裂解**的方法很多，如SDS法、裂解法、煮沸法等。它們各有利弊，應(yīng)根據(jù)所提質(zhì)粒的性質(zhì)、宿主菌的特性及純化質(zhì)粒的方法等因素加以選擇。

本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法。首先破壞**的細(xì)胞壁：再用SDS使細(xì)胞膜崩解，與此同時(shí)用NaOH提高溶液的pH值，使染色體DNA、蛋白質(zhì)及質(zhì)粒均變性。

3． 質(zhì)粒的分離和純化

往**步溶液中加入酸性溶液使裂解液的pH值恢復(fù)到中性，此時(shí)，質(zhì)粒可復(fù)性并恢復(fù)原型，而染色體DNA仍處于變性狀態(tài)。經(jīng)離心，染色體DNA與細(xì)胞碎片一起沉淀。然后，再用酚、氯仿等蛋白質(zhì)變性劑去除蛋白質(zhì)，用Rnase去除RNA，即可得到質(zhì)粒的粗制品。以后，可用超離心法、電泳法、離子交換層析法或排組層析法等進(jìn)一步純化質(zhì)粒。

[儀器與消耗]

1.儀器：電熱手提高壓鍋、恒溫空氣震蕩器、臺(tái)式高速離心機(jī)、旋渦混勻器、顆粒型制冰機(jī)、冰箱、可調(diào)式移液器。

2.耗材：含有重組質(zhì)粒（pUC18/GAPDH）的菌株（HB101）Eppendorf吸管

[步驟]

1.酶切：20μl酶切體系（按下表加試劑）

 質(zhì)粒DNA 10╳酶緩沖液 EcoRI(15u/μL) BamHI(15u/μl) 雙蒸水

實(shí)驗(yàn)組1 6μL 2μL 1μL 1μL 10μL

實(shí)驗(yàn)組2 6μL 2μL 1μL 11μL

對(duì)照組 6μL 2μL — -- 12μL

混勻，37℃水浴1-2小時(shí)。

2.向上述個(gè)反應(yīng)管中，分別加入4μL 6×上樣緩沖液。

3.電泳：

① 將1%濃度的瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml EB）鋪于水平電泳槽上，并插上梳子。

② 待凝膠凝固，將梳子拔出。往電泳槽中注入0.5×TEB緩沖液，直至剛沒(méi)過(guò)凝膠。

③ 按以下順序上樣：

1道 2道 3道 4道

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（Marker） 對(duì)照組樣品（未酶切質(zhì)粒） 實(shí)驗(yàn)組1樣品 實(shí)驗(yàn)組2樣品

④將加樣一端接上負(fù)極，另一端接上正極，電場(chǎng)強(qiáng)度5V/cm，待溴酚藍(lán)移動(dòng)到接近正極一端停止電泳。

⑤將凝膠移至黑暗處，用紫外燈觀察電泳結(jié)果。

[試劑]

1. EcoRI（15u/μL）

2. BamH I（15u/μL）

3. 5×TBE（pH8.3電泳緩沖液）Tris    5.4g

硼酸    2.25g

EDTA     0.46g

ddH2O2定容至       100ml

4. 1%瓊脂糖：瓊脂糖1g，0.5×TBE100ml。

5. 6×上樣緩沖液：50%甘油，1×TBE，0.5%溴酚藍(lán) ,0.5%二甲苯青

6. 溴化乙錠（EB）：0.5mg/ml

質(zhì)粒DNA