一、目的
掌握 Folin 一酚法測定蛋白質含量的原理方法，熟悉分光光度計的操作。
二、原理
Folin 一酚法測定蛋白質含量的過程包括兩步反應：**步是在堿性條件下蛋白質與 Cu 2 +
作用生成絡合物，**步是此絡合物還原 Folin
試劑（磷鉬酸和磷鎢酸試劑），生成深藍色的化合物，且顏色深淺與蛋白質的含量成正比關系。該方法靈敏度高于雙縮脲法
100 倍。硫酸銨、甘氨酸、還原劑如二硫蘇糖醇（ DTT ）、巰基乙醇等會干擾反應。
三、儀器與試劑
1 .儀器
（ 1) 分光光度計
（ 2 ）水浴
（ 3 ）試管
（ 4 ）具塞試管 8 支
（ 5 ）小燒杯 2 支
（ 6 ）漏斗及架
（ 7 ）分析天平
（ 8 ）吸管： 0 . 5m1 X 1 ， 1m1X2 ， 5m1 X 1
（ 9 ）容量瓶： 100m1 X 2 ， loml X 1
（ 10 ）濾紙、玻棒等
（ 11) 研缽
（ 12 ）離心機、離心管
2 .試劑
（ 1 ） 0.5mol/ L NaOH
(2) 試劑甲
1) 稱取 1Og Na2C03 , 2g NaOH 和 0.25g 酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至
500m1 。
2) 0. 5g 硫酸銅 (CuS0 4 • 5H 2 O) 溶解后，用蒸餾水定容至 100m1 。
每次使用前將 A 液 50 份與 B 液 1 份混合，即為試劑甲。此混合液的有效期
只有 1 天，過期失效。
(3) 試劑乙：在 1.5L 容積的磨口回流器中加入 100g 鎢酸鈉 ( Na 2 WO 4 .2H 2 0
）， 25g 鉬酸鈉（ Na 2 Mo 4 .2H 2 0 ）及 700m1 蒸餾水，再加 50m1 85
％磷酸， 100m1 濃鹽酸充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流 10h, 回流結束后，加入 150g 硫酸鋰，
50ml 蒸餾水和數滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰 15min
，驅除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（若仍呈綠色，須再重復滴加液體溴數滴，再繼續(xù)沸騰 15min ）。然后稀釋至
1L ，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時大約加水 1 倍，使*終濃度相當于 1 mol ／ L 鹽酸。
3 .材料
綠豆芽或其他植物材料。
四、操作步驟
1 .標準曲線的繪制
(1) 配置標準牛血清白蛋白溶液：在分析天平上**稱取 0.025g
結晶牛血清白蛋白，倒至小燒杯內，加入小量蒸餾水溶解后轉入 100m1
容量瓶中，燒杯內的殘液用少量蒸餾水沖洗數次，沖洗液一并倒入容量瓶內，*后用蒸餾水定容至刻度，配制成標準蛋自質溶液，其中牛血清白蛋白的濃度為
250 ug/ ml 。
(2) 系列標準牛血清白蛋白溶液的配制：取具塞試管 6
支，按下表加入牛血清白蛋白
標準溶液及蒸餾水。然后各管加入試劑甲 5ml ，混合后在室溫下放置 10min ，再加
0.5ml 試劑乙，立即混合均勻（這一步速度要快，否則會使顯色程度減弱）。 30min 后，以不含蛋白質的 1
號試管為對照，與其他 5 支試管內的溶液依次用分光光度計于 5OOnm 波長下比色。記錄各試管內溶液的吸光度。
試劑 1 2 3 4 5 6
250ug/mg 牛血清蛋白（ ml ） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
H 2 O (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
蛋白質含量（ ug ） 0 50 100 150 200 250
(3) 標準曲線的繪制：以吸光度為縱標，以牛血清自蛋白含量（ ug ）為橫坐標，繪制標準曲線。
2 .樣品測定
（ 1) 稱取綠豆芽下胚軸 1g 于研缽中，加蒸餾水 2m1, 勻漿。轉入離心管，并用 6m1
蒸餾水分次洗滌研缽，并入離心管。 4000r/min 離心 20min. 棄去沉淀，上清液轉入容量瓶，定容至
10m1.
(2) 取具塞試管 2 支，各加入上清液 l ml, 分別加入試劑甲 5m1, 混勻后放置 lomin
，然后加試劑乙 0.5 ml ，迅速混勻，室溫下放置 30min ，于 500nm 波長下比色，記錄吸光值。
五、結果處理
從標準曲線上查出測定液中蛋白質的含量 X （ ug ），然后計算樣品中蛋白質的百分含量。
六、注意事項
Folin 試劑（試劑乙）在堿性條件下不穩(wěn)定，但此實驗中反應在 pH 10 時發(fā)生，因此在 Folin
試劑反應時應立即混勻，否則顯色程度減弱。
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