A：導(dǎo)致這種結(jié)果的因素很多。
    膠和膜放反了 如果在轉(zhuǎn)印的過程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉(zhuǎn)移到緩沖液中，而不會(huì)到達(dá)膜上。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)印，凝膠應(yīng)靠近三明治的負(fù)極，而膜對(duì)應(yīng)正極。
    轉(zhuǎn)膜效率低 轉(zhuǎn)膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場(chǎng)強(qiáng)度、轉(zhuǎn)印時(shí)間和緩沖液的pH值。一般說來，蛋白越大，轉(zhuǎn)移得越慢。轉(zhuǎn)移大蛋白*好的方法是用高的電場(chǎng)強(qiáng)度。而小蛋白長(zhǎng)時(shí)間處于高電場(chǎng)強(qiáng)度下可能會(huì)穿出轉(zhuǎn)印膜。避免這個(gè)問題的方法是用0.2 um孔徑的NC膜或PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印。如果蛋白的等電點(diǎn)接近緩沖液的pH值，那么這個(gè)蛋白攜帶的電荷很少，在電場(chǎng)中也幾乎不移動(dòng)。如果你的目的蛋白是強(qiáng)堿性的，那么你可以用碳酸鹽（pH9.9）、CAPS（pH11）及酸性緩沖液。
    在轉(zhuǎn)印之后，你可以通過染膠或**塊膜來判斷轉(zhuǎn)印效率。為了幫助你直接監(jiān)控轉(zhuǎn)印效率，Bio-Rad也提供了多種預(yù)染Marker，它們?cè)陔娪疽约稗D(zhuǎn)膜之后可直接觀察到。試劑放置太久或存放條件不正確 抗體會(huì)慢慢降解，如果反復(fù)凍融的話，它會(huì)快速降解。底物應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C。
    抗體不純或滴度太低 一抗的濃度差異很大，應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來決定一抗的稀釋度。過猶不及，太多的抗體也會(huì)阻礙抗原與抗體的結(jié)合。一般的原則是以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超**動(dòng)物的血清。Bio-Rad的印跡級(jí)別的二抗稀釋度是1:3000。
    酶失活了 疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要在HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結(jié)合的抗體中，而無副作用。另外，自來水或用聚苯乙烯樹脂去離子的水也可能會(huì)使酶失活，只能使用蒸餾的去離子水。
    使用Tween-20洗滌 Tween-20（吐溫-20）可能會(huì)干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗走NC膜上的目的蛋白。盡管在洗滌時(shí)它的終濃度只有0.05%-0.1%，但仍可能會(huì)影響結(jié)合。因此除了封閉之后的**次洗滌，其他洗滌過程中都不使用Tween-20，不過，這可能會(huì)使背景升高。
    檢測(cè)系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度   確保蛋白的上樣量在檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度范圍內(nèi)：
    辣根過氧化物酶                500 pg/band
    堿性磷酸酶                    100 pg/band
    增強(qiáng)的堿性磷酸酶              5 pg/band
    膠體金                        100 pg/band 
    增強(qiáng)的膠體金                  10 pg/band
    Immun-Star 化學(xué)發(fā)光           10 pg/band
Q：我的western blot總是背景過高，如何解決？

A：背景過高可能是由很多因素引起的：封閉不完全、顯色過度、洗滌不充分、轉(zhuǎn)移緩沖液或設(shè)備有污染、抗體稀釋度不對(duì)或抗體不純。

    封閉不完全 一抗或二抗只要結(jié)合到膜上，就會(huì)顯色。為了避免非特異性的結(jié)合，應(yīng)用封閉液孵育膜，使所有的空白位點(diǎn)都被封閉蛋白占有。NC膜推薦的封閉液是3%的明膠。在室溫孵育1小時(shí)。明膠不能在4℃孵育，因?yàn)樗鼤?huì)凝結(jié)。如果想要低溫封閉的話，可以用3%的BSA。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。脫脂奶粉不能與Bio-Rad生物素化的蛋白標(biāo)準(zhǔn)一起使用。脫脂奶粉濃度過高也可能會(huì)產(chǎn)生背景。生物通 www.ebiotrade.com