背景：在Western Blot的顯色中，常用的標(biāo)記酶包括辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。其中HRP因特異性強(qiáng)、分子量小、穩(wěn)定且作用底物范圍廣等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛使用。然而，某些細(xì)胞中存在大量線粒體，內(nèi)源的過氧化物酶濃度自然比較高，它們可能會(huì)造成膜上出現(xiàn)一些“假的”條帶。
方法改進(jìn)：為了避免內(nèi)源過氧化物酶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們采用下列步驟來消除它。將制備好的胃壁細(xì)胞裂解液與上樣緩沖液混合，上樣到SDS-PAGE膠上。電泳之后，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜之后，立即將膜放置在3% H2O2中，孵育15分鐘。孵育之后，用TBS（25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH 7.5）洗滌，之后用5%脫脂奶粉封閉。接著按照常規(guī)步驟進(jìn)行下去。
結(jié)果：未用H2O2孵育之前，我們?cè)谀ど习l(fā)現(xiàn)了一條約30 kDa的非特異條帶。即使在不加一抗或二抗的情況下，依然在膜上顯色，說明內(nèi)源過氧化物酶存在。經(jīng)過H2O2的孵育，這條帶消失了。這種方法適用于線粒體較多的細(xì)胞（如肝細(xì)胞或中性粒細(xì)胞），能夠讓W(xué)estern Blot的結(jié)果更加特異。
