作為蛋白質組學研究中一種強有力的工具，質譜在過去很長一段時間內只是用于定性研究，鑒定蛋白質和翻譯后修飾。于是，科學家們不斷開發(fā)出定量蛋白質組學方法，來了解細胞、組織或生物體的整體蛋白質動力學。
早期的蛋白質研究致力于鑒定并了解單個蛋白或蛋白復合物的功能，這些年，儀器和技術的進步大大促進了蛋白質組學研究。十年前，我們或許只能分析數百個蛋白，而如今，我們能分析數千個。在這個分析水平，我們可研究細胞、組織或生物體的整體蛋白動力學。這種蛋白質組的研究，與當今熱門的基因組、轉錄組和代謝組等領域的研究一起，讓我們更好地了解了整體的生物過程，以及它們如何應對不同刺激，或在**狀態(tài)下如何改變。
若想了解一個人患病之后，基因表達水平發(fā)生了怎樣的改變，DNA芯片是一個*常見的選擇。然而DNA芯片也許并沒有說出全部，因為基因表達的差異并不一定直接對應著蛋白表達的差異。為了更準確地比較兩個樣本的蛋白水平，科學家們通常使用雙向電泳外加質譜，然而流程復雜，通量低，重復性也欠佳。
作為蛋白質組學研究中一種強有力的工具，質譜在過去很長一段時間內只是用于定性研究，鑒定蛋白質和翻譯后修飾。為什么不能定量？因為各次運行之間，水解后的肽段在理化性質上表現出很大差異，從而導致質譜響應的變化。此外，質譜只能對樣品中的一部分肽段進行分析。于是，科學家們不斷開發(fā)出定量蛋白質組學方法，來了解細胞、組織或生物體的整體蛋白質動力學。
定量蛋白質組學又分為相對定量和**定量。相對定量方法（如SILAC、ICAT、ICPL等）是用來比較樣品之間的蛋白或肽段豐度；而在未標記的樣品中加標有已知濃度的同位素標記的合成肽段，就實現了目標肽段的**定量。
顯然，**定量比相對定量更為理想，因為不同樣品的肽段**值也可用于比較相對蛋白變化。然而，相對定量卻更為常用，因為每個目的蛋白的**定量都需要昂貴的試劑，也需要花費大量的時間來開發(fā)分析。在相對定量方法中，SILAC又是比較常用的一種。
SILAC技術的原理
10年前，SILAC誕生于南丹麥大學。它的***是Matthias Mann教授。2005年，這位牛人教授來到了德國慕尼黑的馬普生物化學研究所。SILAC的全名為stable-isotope labelling by amino acids in cell culture。它的原理很簡單：兩組細胞同時培養(yǎng)，A組是在包含正常氨基酸（light）的培養(yǎng)基中；B組的培養(yǎng)基則含有“重型（heavy）”的氨基酸，即穩(wěn)定同位素標記的氨基酸。*初SILAC使用的標記氨基酸是氚代甲硫氨酸和氘代甘氨酸，目前常用的標記氨基酸有亮氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸等。細胞傳代若干代后，穩(wěn)定同位素標記的氨基酸完全摻入到蛋白中，取代了原有的氨基酸。這樣，兩個蛋白之間就存在分子量的改變，而其它化學性質無異。
然后將兩組細胞混合，提取出蛋白質組，并交給質譜去測定。每個肽段作為質譜中的一對——低分子量的肽段含有輕型氨基酸，來源于A組，高分子量的肽段則含有重型氨基酸，來源于B組。如果SILAC肽段對呈現1：1的比例，則蛋白質組中此蛋白的豐度無差異。如果含有重型氨基酸的肽段峰強度偏高，則說明B組中蛋白豐度更高。因為穩(wěn)定同位素標記的氨基酸與天然氨基酸的化學性質基本相同，除了分子量差異，則質譜上峰強度的比值直接對應了A組與B組的比例。雖然整個實驗的時間主要取決于細胞生長的速率和所采用的各種樣品處理步驟，但一般來說，SILAC實驗從開始到結束，包括數據分析，大約需要20到25天。
SILAC方法有很多優(yōu)勢。細胞在傳代6-8代之后，蛋白標記效率可達90%以上。標記是在樣品處理前引入，隨后進行蛋白質分離、酶切和鑒定，后續(xù)實驗對樣品的影響一致，故樣品處理所帶來的定量誤差（bias）會很低。在檢測極低水平的蛋白變化或翻譯后修飾時，這一點特別有用。此外，SILAC靈敏度高，樣本量要求少，通常每個樣品只需要幾十微克的蛋白量。
當然，這種方法也有限制。一些細胞會將高濃度的精氨酸轉化成脯氨酸，這樣在精氨酸標記的情況下會產生兩個不同的重型峰，代表了精氨酸或脯氨酸標記的肽段。研究人員也開發(fā)出一些方法，來避免這種轉化。對于那些很難培養(yǎng)，或對培養(yǎng)基成分變化極其敏感的細胞系而言，這種代謝標記的方法也不大奏效。此外，這種技術也有可能影響生物體發(fā)揮功能，因為培養(yǎng)條件已改變。
經典的SILAC實驗
2007年，Matthias Mann教授在《Nature Protocols》上發(fā)表了經典SILAC實驗的流程。1 2-3個樣品被分別標記，并在質譜分析中直接比較。來自不同樣品的等量細胞或細胞裂解液混合，并在后續(xù)步驟中作為單個樣品來處理。這樣可使用任一種蛋白或肽段富集方法，也不會擔心在*后的定量分析中引入定量誤差。
經典的SILAC實驗（也就是double-SILAC）比較2個或3個樣品，但是通過兩個triple-SILAC實驗，也可以比較5個樣品，注意，這兩個實驗至少有一個共同樣品。這在時間進程實驗中比較常用。在double-SILAC中，MaxQuant（馬普開發(fā)的軟件包）確定“重型”和“輕型”的肽段比例，而在triple-SILAC中，它確定“重型”與“中等”、“中等”與“輕型”以及“重型”與“輕型”的比例。
動物體的SILAC實驗
2008年，Mann的小組及其他小組的研究表明，SILAC也能用于整個小鼠的同位素標記。2 Mann小組通過給小鼠提供含有13C6賴氨酸的飼料，將SILAC方法拓展應用于體內研究。通過對小鼠飲食、生長發(fā)育、生育能力、活動和生理情況的觀測，發(fā)現SILAC標記對小鼠后幾代都無不利影響。在F2代小鼠體內，他們觀察到13C6賴氨酸幾乎標記了體內所有器官的蛋白質，使得對這一代和以后若干代小鼠進行定量的蛋白質分析成為可能。
Krüger等人采用了三種基因表達缺陷的小鼠模型對上述方法進行了驗證。在每個實驗中，差異標記野生型小鼠和基因表達缺陷的小鼠，然后通過質譜檢測明確證實了相關組織中相應蛋白質的表達缺失。他們的研究結果表明，體內SILAC標記方法是一種多功能工具，能定量比較缺陷小鼠的蛋白質組，從而確定體內復雜環(huán)境中的蛋白功能。
而線蟲的定量蛋白質組分析也開展得如火如荼。去年，兩個小組都采用氨基酸的穩(wěn)定同位素標記（SILAC）方法，開展了線蟲的定量蛋白質組實驗，文章發(fā)表在同一期的《Nature Methods》上。
英國鄧迪大學的Mark Larance等改良了SILAC方法，用一種重型賴氨酸和重型精氨酸標記的大腸桿菌喂養(yǎng)線蟲3。質譜分析表明F1后代中已摻入重型精氨酸和賴氨酸。同時，他們還采用RNAi via feeding策略，靶定了精氨酸-脯氨酸轉化過程中必需的鳥氨酸轉氨酶基因orn-1。質譜結果表明，這種策略幾乎完全避免了精氨酸-脯氨酸的轉化。將此方法與定量蛋白質組方法相結合，研究人員還鑒定了線蟲的熱擊反應。
作者認為，他們的SILAC方法為線蟲的定量蛋白質組研究帶來了很多機會。沒有了精氨酸-脯氨酸的轉化，SILAC實驗可更高效地開展。SILAC技術還能協助確定線蟲發(fā)育、衰老以及壓力過程中的整體蛋白質組變化。
幾乎同時，南丹麥大學生物化學與分子生物學系的Julius Fredens等也使用了非常相似的方法。4 他們用重型同位素標記的大腸桿菌喂養(yǎng)線蟲，得到了重型同位素賴氨酸標記的線蟲。利用標記的線蟲和定量蛋白質組方法，他們鑒定出一些蛋白，響應了線蟲核**受體49（NHR-49）的功能喪失。作者認為，定量蛋白質組學與選擇性基因敲除的結合使用，是研究線蟲的一種強有力工具。
Super-SILAC
因組織樣品的復雜度以及代謝標記在非增殖細胞上的限制，組織蛋白質組學面臨了很大挑戰(zhàn)。之前，研究人員使用SILAC標記的細胞作為“spike-in”對照，解決了標記問題，因為通過與對照比較，可進行每種組織樣品的定量。日本科學家曾將標記的Neuro2A細胞裂解液加入小鼠的腦組織裂解液中，開展小鼠腦組織的定量蛋白質組研究。
然而，考慮到組織的復雜度，以單個細胞系來代表組織似乎是不夠的。此外，若樣品是多樣性的，如腫瘤樣品，則單個細胞系也無法代表這種多樣性。為了克服這些挑戰(zhàn)，Matthias Mann教授及其同事將多個SILAC標記的細胞系混合在一起，作為“spike-in”對照，這就是Super-SILAC（超級SILAC）。1
他們將多個過去建立的癌癥細胞系中的標記蛋白裂解液混合，這樣就復雜度而言，它們比單個細胞系更為**，從而增加了準確性。為了代表更寬范圍的特定腫瘤類型，他們選擇了不同來源、不同階段，且攜帶各種分子標記物的細胞系，并將等量的標記蛋白混合成超級SILAC混合物（super-SILAC mix）。隨后將這些標記蛋白裂解液以1：1的比例與每種組織樣品混合，裂解液充當了組織比較的內部標準。
在乳腺癌組織的研究中，Mann及其同事通過標記四種乳腺癌細胞系，外加一種正常的乳腺上皮細胞類型，以1：1：1：1：1的比例將蛋白裂解液混合，獲得了完整的SILAC-標記蛋白。他們比較了小葉和導管乳腺腫瘤中與轉變過程、化療敏感性和**抗性相關的低豐度蛋白。
這種新方法有潛力將相對蛋白質組定量方法擴展到腫瘤生物學研究的分子方面，并可能成為探索候選生物標記物的工具。SILAC與其他相對定量的質譜技術相比，優(yōu)勢在于靈敏度高、定量準確，且實驗誤差很小，因為樣品在實驗流程的早期就已混合。此外，超級SILAC方法還有可能成為了解癌癥分子機制的寶貴工具。
開展SILAC研究的工具
賽默飛世爾（Thermo Fisher Scientific）在收購HyClone和Pierce之后，在SILAC方面的產品線還是相當豐富的。除了經典的SILAC培養(yǎng)基（RPMI-1640和DMEM）外，賽默飛世爾近年來也推出了不少新產品。
SILAC培養(yǎng)基 & 血清
所有的SILAC培養(yǎng)基都不含有L-賴氨酸和L-精氨酸。對于經典的RPMI-1640和DMEM，賽默飛世爾提供了液體（500mL）和粉劑（可配成10L）的包裝。除此之外，它還有專門用于SILAC的MEM、DMEM:F12、F12、IMDM、McCoy’s 5A等培養(yǎng)基。當然，這些還不夠。為了滿足干細胞研究的需求，它還推出了用于SILAC的小鼠干細胞擴增DMEM，低滲透壓小鼠干細胞DMEM。而無酚紅MEM培養(yǎng)基適用于易受雌**刺激的細胞，如乳腺癌細胞系MCF7，而不會產生人為的雌**反應。此外，賽默飛世爾還提供透析過的FBS、干細胞專用的透析FBS以及血清替代物。
重型 & 輕型氨基酸
賽默飛世爾還單獨提供了同位素標記的氨基酸，可與上面提到的缺陷型培養(yǎng)基共同使用。重型和輕型L-賴氨酸和L-精氨酸是SILAC分析中*常用的氨基酸。利用氨基酸的不同同位素，可輕松分析三種不同的實驗條件。以賴氨酸為例，4,4,5,5-D4 L-賴氨酸和13C6 15N4標記的L-賴氨酸與輕型賴氨酸相比分別有4-和8-Da的分子量變化。而13C6 L-精氨酸和13C6 15N4 L-精氨酸則分別比輕型精氨酸的分子量高了6-和10-Da。L-亮氨酸也是SILAC中很常用的氨基酸。此外，賽默飛世爾還提供了L-脯氨酸作為培養(yǎng)基添加劑，以防止同位素標記的精氨酸代謝轉換成脯氨酸。
SILAC實驗流程
據賽默飛世爾介紹，SILAC流程如下：利用含有0.1毫克/毫升的重13C6 L-賴氨酸-2HCl或輕L-賴氨酸-HCl，并且在含有10%透析過的FBS的SILAC DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)A549細胞，培養(yǎng)六代（10天）。在完全標記后，利用5 μM喜樹堿處理13C6 L-賴氨酸標記的細胞24小時。利用Thermo Scientific M-PER哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑裂解來自每種樣品（輕和重）的細胞。將樣品按照使用Thermo Scientific BCA蛋白定量試劑測定的蛋白濃度進行標準化，然后從每種樣品中取50毫克并混勻，此后利用4-20%的SDS-PAGE分析樣品。利用Thermo Scientific GelCode藍色染色試劑對凝膠進行染色，再利用Thermo Scientific 膠內胰酶消化試劑盒對蛋白進行消化和烷基化，*后利用LTQ Orbitrap雜交質譜進行分析。
