一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1.通過對(duì)DNA的酶切，學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)構(gòu)建體外重組DNA 分子;
2.根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內(nèi)切酶 ;
3.掌握DNA的酶切技術(shù)。
二、實(shí)驗(yàn)原理
限制性內(nèi)切酶是從** 中分離出來的一種能在特異位點(diǎn)切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶，目前已從多種**中分離出超過400種，識(shí)別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對(duì)稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識(shí)別：…GAATTC… 切割后產(chǎn)生
…CTTAAG…
…G和AATTC…的末端，
…CTTAAG…
該末端由于有一段小的能互補(bǔ)配對(duì)的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團(tuán)。即…G-OH
…CTTAA-P。
有的限制性酶識(shí)別四堿基對(duì)的順序，如 San3A識(shí)別 GATC ;有的識(shí)別六
CTAG
堿基對(duì)，如上述的ECOR I。識(shí)別四堿基對(duì)的內(nèi)切酶由于識(shí)別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高(四堿基酶為44=256，六堿基酶為46=4096)，因而可將DNA切割成更小的片段，而識(shí)別八堿基對(duì)的Not I
…GCGGCCGC…
…CGCCGGCG… 則識(shí)別和切割位點(diǎn)更少(48=65536)，但堿基并不以均等的概率出現(xiàn)，因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。
限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃，反應(yīng)體系中以Mg2+為**的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。
商品酶都保存在50%的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl(每單位即*適條件下1小時(shí)內(nèi)完全酶解1μg DNA的酶量)。
三、實(shí)驗(yàn)材料
待酶切的DNA樣品
四、實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及試劑
儀器：可調(diào)微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)燈
器皿：Eppendorf管、Tip、試管架
試劑：Hind III酶切標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量
Hind III限制性內(nèi)切酶
10×buffer：50mmol/lNaCl
10mmol/lTris-HCl(pH7.5)
10mmol/lMgCl2
lmmol/l DTT(二硫蘇糖醇)
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1.將DNA樣品lμg溶解在16μl重蒸水中(在**的Eppendorf管中進(jìn)行)
2.加入2μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。
3.加入1~2u的限制性內(nèi)切酶Hind III(限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質(zhì)，吸完后盡快放回冰箱)。
4.混勻反應(yīng)液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育1小時(shí)。
5.終止反應(yīng)加入 0.5mol/l EDTA-Na2至終濃度為10mmol/l。
6.進(jìn)行電泳檢查酶切結(jié)果，100V 0.5~1小時(shí)。
7.紫外燈下觀察消化效果。
六、注意事項(xiàng)
1.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)大多為微量操作，DNA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性以保證酶切效果*佳?，F(xiàn)介紹三種微量取樣方法：
(1)吸樣時(shí)，將Tip尖剛剛接觸到液面時(shí)，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會(huì)沾上很多的樣品，導(dǎo)致吸樣不準(zhǔn)。
(2)用1cm長(zhǎng)的塑料毛細(xì)管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。
(3)目前也有細(xì)長(zhǎng)Tip出售，專門用于吸取微量樣品。
2.限制性內(nèi)切酶價(jià)格比較貴，因此要注意不使其污染而導(dǎo)致浪費(fèi)。這就要求每次吸酶時(shí)要用新的無菌Tip。另一個(gè)造成限制性內(nèi)切酶浪費(fèi)的因素就是限制性內(nèi)切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項(xiàng)試劑加好后，*后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內(nèi)切酶拿出冰箱的時(shí)間盡可能短。
若用同一酶消化很多樣品時(shí)，可先計(jì)算出所需酶量(可稍多計(jì)一點(diǎn))，取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個(gè)反應(yīng)管內(nèi)。這樣可節(jié)約用酶且縮短操作過程、減少污染機(jī)會(huì)。
3.開啟Eppendorf管時(shí)，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防雜酶污染。
4.樣品在37℃與65℃保溫時(shí)，要注意將Eppendorf管蓋嚴(yán)，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實(shí)驗(yàn)失敗。
5.無實(shí)驗(yàn)必要應(yīng)盡量避免長(zhǎng)時(shí)間酶消化樣品。因長(zhǎng)時(shí)間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。
