綠色植物的光合作用是在葉綠體中進(jìn)行的，了解葉綠體色素的組成和性質(zhì)對(duì)于理解光合作用的本質(zhì)很有幫助。葉片中葉綠素含量與光合強(qiáng)度以及氮素營(yíng)養(yǎng)又有密切關(guān)系。因此，測(cè)定葉綠素含量便成為研究光合作用與氮代謝必不可少的手段，在作物育種、科學(xué)施肥、看葉診斷中有著廣泛的應(yīng)用。

原理

當(dāng)溶劑沿支持物不斷向前推進(jìn)時(shí)，由于葉綠體中不同色素分子結(jié)構(gòu)不同，在兩相(流動(dòng)相與固定相)間具有不同的分配系數(shù)，因此它們移動(dòng)速率不同。對(duì)葉綠體色素進(jìn)行層析可將不同色素分離。下面介紹紙層析和硅膠薄板層析分離葉綠體色素的方法。

一、紙層析法分離葉綠體色素

器材與試劑

方法一需要：大試管、軟木塞、大頭針、回形針、濾紙、毛細(xì)管、電吹風(fēng)、剪刀、四氯化碳、無(wú)水硫酸鈉。

方法二需要：培養(yǎng)皿一套(底和蓋口徑相同)、濾紙、剪刀、小燒杯(5ml)、汽油、苯。

方法與步驟

方法一：將2×22cm的濾紙的一端剪去二側(cè)，中間留一長(zhǎng)約1.5cm、寬約0.5cm窄條。用毛細(xì)管取葉綠體色素濃溶液點(diǎn)于窄條上端，用電吹風(fēng)吹干，如一次點(diǎn)樣量不足可反復(fù)在色點(diǎn)處點(diǎn)樣數(shù)次，使色點(diǎn)上有較多的葉綠體色素。在大試管中加入四氯化碳3-5ml及少許無(wú)水硫酸鈉。然后將濾紙條固定于軟木塞上，插入試管內(nèi)，使窄端浸入溶劑中，而色點(diǎn)略高于液面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁，軟木塞蓋緊，直立于陰暗處層析。

0.5-1小時(shí)后，觀察色素帶分布：*上端橙黃色(胡蘿卜素)，其次黃色(葉黃素)，再崐次藍(lán)綠素(葉綠素a)，*后是黃綠色(葉綠素b)。

方法二：取一張色層分析濾紙，剪成直徑稍比培養(yǎng)皿直徑大一點(diǎn)的圓形(正方形也可)，在濾紙的中心戳一小孔。另取一長(zhǎng)5cm、寬1.5cm的濾紙條，用滴管吸取葉綠體色素提取液滴在紙條一邊，使色素?cái)U(kuò)展的寬度限制在0.5cm以內(nèi)，電吹風(fēng)吹干后，再重復(fù)數(shù)次，(也可把濃葉綠體色素溶液放在平底培養(yǎng)皿中，用濾紙一側(cè)蘸葉綠體色素)，然后將紙沿著長(zhǎng)軸方向卷成紙捻，使浸過(guò)葉綠體色素溶液的一側(cè)恰好在紙捻的一端。

將紙捻帶有色素的一端插入圖形濾紙的中心處的小孔中，使與濾紙剛剛平齊。

在培養(yǎng)皿內(nèi)放一小燒杯(5ml)，杯內(nèi)加入適量汽油和1～2滴苯，把插有紙捻的濾紙平放在培養(yǎng)皿上，使紙捻的下端浸在汽油中，蓋好培養(yǎng)皿，此時(shí)汽油借毛細(xì)管引力順捻擴(kuò)散到圓形濾紙上，并把葉綠體色素沿著濾紙的四周推進(jìn)，不久即可看到被分離的各種色素的同心環(huán)，待汽油將要達(dá)到培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，取出濾紙，用筆標(biāo)出各色素位置與名稱、葉綠素a呈藍(lán)綠色，葉綠素b呈黃綠色，葉黃素呈鮮黃色胡蘿卜素為橙黃色。

二、硅膠薄板層析分離葉綠體色素

器材與試劑

器材：FS玻璃板(5×20cm2)、烘箱、干燥器、層析缸、毛細(xì)管、電吹風(fēng)、分光光度計(jì)、

解剖針、刀片、試管、試管架等。

試劑：硅膠G、苯、冰醋酸。

方法與步驟

1. 層析板制作。將硅膠G與蒸餾水以1：2比例混合，加幾滴酒精攪勻后，均勻涂布在干凈的玻璃板上，成一薄層，并平放在水平桌面上涼干，然后放在105-110℃烘箱中烘半小時(shí)，置干燥器中備用。

2. 點(diǎn)樣。用毛細(xì)管或微量注射器吸取濃縮的葉綠體色素點(diǎn)樣于薄板上，并成一直線(離一端1.5-2cm處)，也可反復(fù)點(diǎn)樣數(shù)次，以增加薄層對(duì)樣品的載量，點(diǎn)樣線不可太粗，應(yīng)控制在2mm左右。

3. 展層：將點(diǎn)過(guò)樣的薄板置于已預(yù)先用苯：冰醋酸為9：1的展層溶劑(也可用石油醚:丙酮:正丁醇=90:10:4.5的混合液)飽和的層析液中，點(diǎn)樣線高于展層溶劑，采用上行垂直展層，待展層溶劑前沿走至離玻璃板另一端還有1-2cm時(shí)取出，可觀察到色素已分離為若干條色帶，加以記錄和辨認(rèn)。

4. 計(jì)算分配系數(shù)(Rf)值：

原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離(r)/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離

5. 色素吸收光譜的測(cè)定：

① 將薄層層析分離出的各色素用刀片或解剖針刮入具塞試管中。

② 各加入5ml的丙酮，溶解后，傾出各管上清液備用。

③ 將各管上清液分別倒入比色杯，以丙酮為空白，在分光光度計(jì)上測(cè)定各種色素的吸收光譜(自400nm開始，直讀到750nm為止，每隔10nm記錄一次透光率)，并在坐標(biāo)紙上，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，透光率為縱坐標(biāo)，畫出各色素的吸收光譜曲線。

也可同時(shí)測(cè)定一下未經(jīng)層析分離的葉綠體色素的吸收光譜，并與各色素的吸收光譜比較。