描述

1-NM-PP1是可滲透細(xì)胞的蛋白激酶D (PKD) 抑制劑，IC50 為0.398 μM。

相關(guān)類別

信號(hào)通路 >> 細(xì)胞凋亡 >> PKD

研究領(lǐng)域 >> 癌癥

靶點(diǎn)

Cdk7as/as:50 nM (IC50)

體外研究

來自Cdk7as / as或Cdk7 + / +細(xì)胞的Cdk7被免*疫沉淀并測試其對(duì)含Pol II CTD的融合蛋白（GST-CTD）和人Cdk2的激酶活性。從突變體中回收的Cdk7，但不是野生型細(xì)胞，被1-NM-PP1（1-NMPP1）抑制，與任一底物的IC50為~50nM。用Cdk7as /替換野生型Cdk7也使得對(duì)1-NM-PP1敏感的HCT116細(xì)胞生長。在沒有1-NM-PP1的情況下，野生型和Cdk7as / as細(xì)胞的群體倍增時(shí)間分別為~17.9和~20.2h，在異步培養(yǎng)中具有相似的細(xì)胞周期分布，表明Cdk7功能受到的影響*小。 F91G突變本身。純合的Cdk7as / as細(xì)胞對(duì)1-NM-PP1敏感，然而，在暴露1-NM-PP1 96小時(shí)后通過細(xì)胞活力（MTT）測定測得IC50~100nM。相反，野生型HCT116細(xì)胞對(duì)10μM1-NM-PP1具有抗性。 10μM1-NM-PP1的添加延緩了突變體的G1 / S進(jìn)展，但不抑制野生型細(xì)胞的G1 / S進(jìn)展。當(dāng)與血清同時(shí)添加至Cdk7as /作為細(xì)胞時(shí)，1-NM-PP1防止在接下來的15小時(shí)內(nèi)任何進(jìn)展至S期。 24小時(shí)后，有證據(jù)表明，Cdk7as /作為從血清饑餓中直接釋放到含有1-NM-PP1的培養(yǎng)基中的細(xì)胞進(jìn)入S期，而一部分保留在G1中。在血清添加后3小時(shí)或6小時(shí)添加1-NM-PP1可延遲S期進(jìn)入約7小時(shí)或約3小時(shí)[1]。

激酶實(shí)驗(yàn)

進(jìn)行免*疫印跡和免*疫沉淀以及免*疫復(fù)合物的激酶測定。為了測量Cdk1 /細(xì)胞周期蛋白B組裝，從有絲分裂或G2細(xì)胞中提?。?00μg總蛋白）與2μM1-NM-PP1或DMSO預(yù)孵育，然后加入500ng純化的細(xì)胞周期蛋白B1，氨基末端用六組氨酸標(biāo)記和Myc表位，以及ATP再生系統(tǒng)。在指出的情況下，孵育用400ng純化的Csk1或600ng野生型或類似物敏感的T-環(huán)磷酸化的Cdk7 /細(xì)胞周期蛋白H / Mat1復(fù)合物補(bǔ)充。在室溫下90分鐘后，用抗Myc抗體免*疫沉淀Myc-細(xì)胞周期蛋白B和相關(guān)蛋白，并用抗Myc和抗Cdk1抗體對(duì)免*疫復(fù)合物進(jìn)行免*疫印跡，并測試組蛋白H1激酶活性[1]。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

通過在無血清培養(yǎng)基中孵育48小時(shí)使野生型或Cdk7as /作為HCT116細(xì)胞同步，并釋放到含有10％胎牛血清的培養(yǎng)基中。進(jìn)行與胸苷或諾考達(dá)唑的同步，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布。通過MTT測定法測量細(xì)胞活力[1]。

參考文獻(xiàn)

[1]. Larochelle S, et al. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol Cell. 2007 Mar 23;25(6):839-50.

1-(2-Methyl-2-propanyl)-3-(1-naphthylmethyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

1-NM-PP1

1-tert-butyl-3-(naphthalen-1-ylmethyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

1-(1,1-dimethylethyl)-3-(1-naphthalenylmethyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

1H-Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine, 1-(1,1-dimethylethyl)-3-(1-naphthalenylmethyl)-

8278642

1-tert-butyl-3-(naphthalen-1-ylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine

4-Amino-1-tert-butyl-3-(1'-naphthylmethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine

Mutant Kinases Inhibitor II

PP1 Analog II,1NM-PP1

1-NMPP1