2021年6月24日訊/生物谷BIOON/---哺乳動物中的X染色體失活（XCI）使得XX雌性相對于XY雄性的X連鎖基因表達(dá)水平相等。XCI過程由非編碼RNA Xist（X 染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄物）控制，它在需要失活的X染色體中表達(dá)，在那里順式積累并招募基于染色質(zhì)的基因沉默所需的因子。順式限制在單個染色體區(qū)域的分子基礎(chǔ)尚不清楚，但人們認(rèn)為這涉及特定的Xist RNA結(jié)合蛋白（例如CIZ1和SPEN）與核蛋白支架之間的相互作用。

為了更好地了解Xist RNA的獨(dú)特和不尋常的行為，來自英國牛津大學(xué)的研究人員在一項(xiàng)新的研究中，開發(fā)出RNA-SPLIT（sequential pulse localization imaging over time, 時間序列脈沖定位成像）：一種在經(jīng)歷XCI的細(xì)胞中對單個Xist分子進(jìn)行時間分辨成像的方法。他們利用BglG/Bgl莖環(huán)系統(tǒng)來標(biāo)記特定的RNA和一種BglG-HaloTag融合蛋白。在活細(xì)胞（用多西環(huán)素誘導(dǎo)的Xist RNA進(jìn)行改造的小鼠XX胚胎干細(xì)胞）中用不同的熒光HaloTag配體連續(xù)脈沖，使得他們能夠使用超分辨率三維結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（3D-SIM）對單一Xist RNA分子進(jìn)行時間分辨率成像。相關(guān)研究結(jié)果近期發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“Time-resolved structured illumination microscopy reveals key principles of Xist RNA spreading”。

與以前的工作一致，這些作者觀察到每個細(xì)胞中由大約50到100個Xist分子組成的區(qū)域（下稱Xist區(qū)域）。他們確定了誘導(dǎo)后1.5至5小時的時間窗口，在此期間，他們可以定量確定Xist分子在Xist區(qū)域內(nèi)的逐漸增加，被稱為擴(kuò)展階段（expansion phase）。一個較晚的時間點(diǎn)（誘導(dǎo)后24小時）被作為穩(wěn)態(tài)下Xist RNA行為的代表。RNA-SPLIT的應(yīng)用使他們能夠測量這兩種階段中Xist RNA動態(tài)的關(guān)鍵參數(shù)。在擴(kuò)張期和穩(wěn)定期，Xist分子分別大約每2或4小時周轉(zhuǎn)一次。通過多西環(huán)素沖刷抑制Xist轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致Xist RNA穩(wěn)定性明顯增加，這表明存在一種反饋機(jī)制來平衡轉(zhuǎn)錄和周轉(zhuǎn)率。他們觀察到在擴(kuò)展階段Xist RNA區(qū)域的徑向逐漸擴(kuò)大，估計(jì)速度為每小時8立方微米。徑向擴(kuò)大在穩(wěn)定狀態(tài)下并不明顯，這表明一旦建立了X染色體失活，Xist RNA分子就會以一種更隨機(jī)的方式定位。RNA-SPLIT進(jìn)一步顯示，新合成的Xist分子主要定位于存在事先合成的Xist分子的位點(diǎn)---他們稱之為耦合（coupling）。

這些作者擴(kuò)展了他們的分析，以探究剔除CIZ1和SPEN的影響，這兩個因子與Xist RNA的定位和順式限制有關(guān)系。CIZ1的功能喪失導(dǎo)致Xist RNA在分化的細(xì)胞中廣泛地散布于細(xì)胞核，這會增加Xist RNA的轉(zhuǎn)錄水平和穩(wěn)定性。盡管Xist RNA廣泛散布于細(xì)胞核，但之前合成和新合成的Xist分子的耦合仍然保留。SPEN的功能喪失導(dǎo)致了Xist RNA長距離定位存在重大缺陷，降低了Xist RNA的穩(wěn)定性，并破壞了Xist RNA的耦合。SPEN在Xist RNA行為中的功能與它在XCI中基于染色質(zhì)的基因沉默中的功能在遺傳上是可分離的。

綜上所述，RNA-SPLIT的開發(fā)使得XCI建立過程中單個Xist分子的空間定量分析成為可能。這種方法的應(yīng)用揭示了Xist RNA行為（包括對Xist周轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)錄的反饋控制、Xist RNA擴(kuò)散的動力學(xué)以及之前合成和新合成的Xist分子的耦合）的基本原則。除了這些見解之外，RNA-SPLIT還促進(jìn)了人們對CIZ1和SPEN因子如何影響Xist RNA行為和定位的不同方面的理解。（生物谷 Bioon.com）