PCR的基本概念
聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）是一種分子生物學技術，用于體外擴增特定的DNA片段。
PCR技術主要過程是，通過人類合成的一小斷單鏈DNA片段（叫做引物）與模板DNA特定的區(qū)域特異性結合，進而以四種dNTP為底物，通過DNA聚合酶沿著引物和模板形成的雙鏈部分的3’端聚合形成DNA片段實現(xiàn)DNA體外擴增的過程。其中，*重要的是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，由于該酶在97度以上的高溫也能保持穩(wěn)定，所以我 們可以通過94～97度這個溫度范圍內處理DNA形成單鏈，然后降溫（根據(jù)引物不同而有差異，一般為50-55度）直至適量的引物結合到模板上。*后溫度提升至72度，聚合酶聚合形成雙鏈DNA。
經(jīng)典方法
PCR體系組分
DNA模板（template），含有需要擴增的DNA片斷。
2個引物（primer），決定了需要擴增的起始和終止位置。
DNA聚合酶（polymerase），復制需要擴增的區(qū)域。
脫氧核苷三磷酸（dNTP），是指4種脫氧核糖核酸，用于構造新的互補鏈。
緩沖體系，提供適合聚合酶行使功能的化學環(huán)境。
H2O 為了保持各個組分的濃度，在體系中加水稀釋
注意：部分品牌緩沖液不含有Mg2+，那么還需要添加對應濃度的Mg2+。酶請*后加入，水請*先加入。
PCR步驟
1. DNA變性
（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。
2. 退火
（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
3. 延伸
（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性*佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
PCR的循環(huán)參數(shù)
1. 預變性（Initial denaturation）
模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。
退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進行（Taq酶*適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略 延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產生非特異擴增。
6. *后延伸
在*后一個循環(huán)后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產物退火成雙鏈。
結果分析
1、假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
2、假陽性
出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓**。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3、出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
4、出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
問答
Q1.PCR各組分應該按照什么順序怎么添加？
A. 水-buffer-dNTP或Mg+-酶，分裝，模板。
Q 2．要如何設計對照實驗？
A. PCR一般要設兩個對照：
陽性對照：用比較容易擴增出來的體系。比如以前次次都可以擴出來的體系，也可以用16s的，因為這個*好擴。
陰性對照：就是你本次擴增的目的體系不加Taq酶即可。
Q 3.PCR產物是否需要用凝膠純化？
A. 如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
Q 4.模板濃度越高越好嗎？
A. 模板濃度不是越高越好,有時候會適得其反
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