一、知識(shí)背景：
1、基因表達(dá)：DNA RNA Protein
單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因 104個(gè)絲心蛋白mRNA（每個(gè)mRNA存活4d，可以合成105個(gè)絲心蛋白） 共合成109個(gè)絲心蛋白。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。
2、PCR技術(shù)(olymerase chain reaction)：即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：
A、變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；
B、退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5' 3'方向延伸。
以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。
3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR
逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：
1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA**條鏈；
2、Rnase水解活性：水解RNANA雜合體中的RNA；
3、依賴DNA的DNA聚合酶活性：以**條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.
二、RT-PCR的準(zhǔn)備：
1、引物的設(shè)計(jì)及其原則：
1）引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過(guò)程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。
2）引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括
a、引物長(zhǎng)度:一般為15～30bp ，引物太短會(huì)影響PCR的特異性，引物太長(zhǎng)PCR的*適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq酶的*適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。
b、堿基分布：四種堿基*好應(yīng)隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。
c、 3'端要求：3'端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時(shí)錯(cuò)配的引發(fā)效率*低，G、C居中間，因此引物的3'端*好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的T。
d、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。
e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù)堿基互補(bǔ)，3'端不應(yīng)超過(guò)2個(gè)。
f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。
g、5'端無(wú)嚴(yán)格限制：5'末端堿基可以游離，但*好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點(diǎn)等）等等。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對(duì)于這些條件都可以自行設(shè)置。
2、耗材：實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過(guò)0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過(guò)程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（**和滅活DEPC）。
3、試劑準(zhǔn)備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的*關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活 性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時(shí)，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過(guò)RNA酶的阻抑蛋白R(shí)nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異 硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。
實(shí)驗(yàn)操作步驟
一、實(shí)驗(yàn)器具與材料：
1、移液槍：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl
2、吸頭：1ml、200μl、20μl
3、勻漿管：5ml
4、吸頭臺(tái)：放置1ml吸頭的一個(gè)，放置20μl吸頭的一個(gè)
5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl
6、試劑瓶：2個(gè)60ml的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）
1個(gè)125ml的白色試劑瓶（放無(wú)水乙醇）
7、量筒：50ml、250ml、500ml
8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml
9、試管架：5ml、1.5ml、20μl
10、鹽水瓶：250ml、500ml各2個(gè)備用，一個(gè)裝無(wú)水乙醇，另一個(gè)裝DEPC水
11、鋁制飯盒：4個(gè)
12、塑料小飯盒：1個(gè)
13、大瓷缸：2個(gè)
RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟
14、錫泊紙：一卷
15、卷紙：2卷
16、三角燒瓶：帶蓋，稍大
二、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備
1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）
先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過(guò)夜，然后高壓，再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再高壓一次（EP管）
2、玻璃制品：泡酸過(guò)夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1‰DEPC過(guò)夜，再烤干）
3、勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC）
三、試劑配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。
2、75%乙醇：用無(wú)水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高壓）
3、異丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、瓊脂糖
四、幾種緩沖液的配制：
1、電泳緩沖液：
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5M EDTA 20ml？ pH8.0
蒸溜水 1000ml
5×TBE （貯存液）
再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時(shí)使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液 450ml水--→500ml工作緩沖液
2、上樣緩沖液：
0.25%溴酚藍(lán)
0.25%二甲苯青FF
RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟
30%甘油
6×緩沖液，4℃保存
五、瓊脂糖凝膠的配制：
1、1.0%：
1.0g瓊脂糖 100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60℃時(shí)加入10mg/ml溴化乙錠2.5μl，充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進(jìn)行電泳。
2、1.5%:
同上，將瓊脂糖的量改為1.5g
