1.安裝夾心式垂直板電泳槽

夾心式垂直板電泳槽操作簡單，不易滲漏。這種電泳槽兩側(cè)為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由一個上框形凝膠框、長與短玻璃板及樣品槽模板(梳子)所組成。電泳槽由上儲槽(白金電極在上或面對短玻璃板)，下儲槽(白金電極在下或面對長玻璃板)和回紋狀冷凝管組成。兩個電極槽與凝膠模間靠儲液槽螺絲固定。各部間依下列順序組裝：

(1)將上儲槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。

(2)將上、短玻璃板分別插到上框形硅橡膠的凹形槽中。注意勿用手接觸灌膠面的玻璃。

(3)將已插好玻璃板的凝膠模平放在上儲槽上，短玻璃板應(yīng)面對上儲槽。

(4)將下儲槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳蟽Σ?，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽 。

(5)豎直電泳槽，在長玻璃板下端與硅膠?？蚪唤绲目p隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂(糖)。其目的是封住空隙，凝固后的瓊脂(糖)中應(yīng)避免有氣泡。

2.配膠

① 分離膠 20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液中，凝膠緩沖液(pH8.9)2.5ml，分離膠貯液5.0ml，重蒸餾水2.5ml，充分混勻，抽氣10min，*后加AP 10 ml。

② 濃縮膠 pH6.7 25% PAA：濃縮膠緩沖液∶濃縮膠貯液∶40%蔗糖溶液∶核黃素溶液按1∶2∶4∶1的比例混合。

3.制備凝膠板

不連續(xù)體系采用不同孔徑及pH的分離膠與濃縮膠 ，凝膠制備應(yīng)分2步進行。

① 分離膠的制備：根據(jù)實驗要求，選擇*終丙烯酰胺的濃度，本實驗需20ml pH8.9 7.0 %PAA溶液，其加膠方式不同于連續(xù)系統(tǒng)。混合后的凝膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1cm注射器在凝膠表面沿短玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水(約3-4mm)用于隔絕空氣，使膠面平整。為防止?jié)B漏，在上、下儲槽中加入略低于膠面的蒸餾水。約30-60min凝膠完全聚合，則可看到水與凝固的膠面有折射率不同的界線。用濾紙條吸去多余的水，但不要碰破膠面。如需預(yù)電泳，則上、下儲槽的蒸餾水倒去，換上分離膠緩沖液，10mA電流電泳1h，終止電泳后，棄去分離膠緩沖液，用注射器取濃縮膠緩沖液洗滌膠面數(shù)次，即可制備濃縮膠。

② 濃縮膠制備：濃縮膠為pH6.7 25% PAA，混合均勻后用細(xì)長的滴管將凝膠溶液加到長、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，距短玻璃板上緣0.5cm處，輕輕加入樣品槽模板。在上、下儲槽中加入蒸餾水，但不能超過短玻璃板上緣。在距離電極槽10cm處，用日光燈或太陽照射，進行光聚合，但不要造成大的生溫。在正常情況下，照射6-7min，則凝膠由蛋黃透明變成乳白色，表明聚合作用開始。繼續(xù)光照30min，使凝膠聚合完全。光聚和完成后放置30-60min，輕輕取出樣品槽模板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的液體，加入稀釋10倍pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液。使液面沒過玻璃板約0.5cm，即可加樣。

4.加樣

作為分析用的PAGE加樣量僅需幾微克，2-3ul血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶。為防止樣品擴散，應(yīng)在樣品中加入等體積40%蔗糖(內(nèi)含少許溴酚蘭)。用微量注射器取5ul上述混合液，通過緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開始電泳。

5.電泳

將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接(方向切勿接錯)。接通冷卻水，打開電泳儀開關(guān)，開始時將電流調(diào)至10 mA 。待樣品進入分離膠時將電流調(diào)至20-30mA。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離橡膠框下緣1cm時，將電流調(diào)回到零，關(guān)電源及冷卻水。分別收集上、下貯槽電極緩沖液置試劑瓶中，4℃貯存還可用1-2次。旋松固定螺絲，取出硅橡膠框，用不銹鋼鏟輕輕將一塊玻璃板撬開移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。

6.固定，染色

本實驗采用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250(內(nèi)含20%磺基水楊酸)染色液，染色與固定同時進行，使染色液沒過膠板，染色30min左右。

7.脫色

用7%乙酸侵泡漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去。如用50℃水浴或褪色搖床，則可縮短褪色時間。脫色液經(jīng)活性碳脫色后，可反復(fù)使用。

(四)注意事項

1.制備凝膠應(yīng)選用高純度得試劑，否則會影響凝膠聚合與電泳效果。Acr及Bis是制備凝膠得關(guān)鍵試劑，如含有丙烯酸或其它雜質(zhì)，則造成凝膠聚合時間延長，聚合不均勻或不聚合，應(yīng)將它們分別純化后方能使用。Acr及Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，實驗表明對小鼠得半致死量為170mg/kg，操作應(yīng)在通風(fēng)中進行。Acr的純化：稱70gArc溶于1000ml 50℃預(yù)熱的氯仿中，溶解后趁熱過濾。冷卻后，置-20℃低溫冰箱中，則有白色結(jié)晶析出，用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，收集白色結(jié)晶，再用預(yù)冷的氯仿淋洗幾次，真空干燥后置棕色瓶中密封儲存。Acr的熔點為84.5+0.3。純Acr水溶液pH應(yīng)是，其pH值變化不大于0.4pH單位就能使用。Bis的純化：稱12gBis，使其溶于1000ml預(yù)熱40-50℃ 的丙酮中，趁熱過濾。冷卻后，置-20℃ 低溫冰箱中，待結(jié)晶析出后，用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，收集結(jié)晶，用預(yù)冷丙酮洗滌數(shù)次，真空干燥后置棕色瓶阿訇密封保存，Bis熔點為185℃。Acr和Bis的儲液在保存過程中，由于水解作用而形成丙烯酸和NH3，雖然溶液放在棕色試劑瓶中，4℃儲存能部分防止水解，但也只能儲存1-2個月，可測pH值(4.9-5.2)來檢查試劑是否失效。

2.由于與凝膠聚合有關(guān)的硅橡膠條、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時會造成凝膠板與玻璃或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠;剝交時凝膠板易斷裂，為防止次現(xiàn)象，所以器材應(yīng)嚴(yán)格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡抹海綿蘸取“洗潔凈”仔細(xì)清洗。玻璃板侵泡在重鉻酸鉀洗液3-4h或0.2mol/LKOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復(fù)刷洗，*后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。

3.安裝電泳槽和鑲有長、短玻璃的硅橡膠框時，位置要端正，均勻用力旋轉(zhuǎn)緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。

4.用瓊脂(糖)封底及灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。

5.凝膠完全聚合后，必須放置30min-1h，使其充分“老化”后，才能輕輕取出樣品槽模板，切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳區(qū)帶扭曲。

6.為防止電泳后區(qū)帶拖尾，樣品中鹽離子強度應(yīng)盡量低，含鹽量高的樣品槽可用透析法或凝膠過濾法脫鹽。*大加樣量不得超過100ug蛋白/100ul。

7.在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠聚合后進行，洗凈膠面后才能制備膿縮膠。濃縮膠制備后， 不能進行預(yù)電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng)。

8.電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯，以免樣品反方向泳動，電泳時應(yīng)選用合適的電流、電壓、過高或過低均可影響電泳效果。

9.電泳后，應(yīng)分別收集上下儲槽電極緩沖液，在冰箱儲存，可用2-3次。為保證電泳結(jié)果滿意，*好用新稀釋的緩沖液。