1、了解微生物分離和純化的原理；

2、掌握常用的分離純化微生物的方法；

3、掌握菌落特征的觀察。

4、學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)

5、 建立無菌操作的概念，掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)

二、實(shí)驗(yàn)原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個(gè)菌落，通常是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲取單個(gè)菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術(shù)完成。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。

土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。

將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)*基本的操作技術(shù)。無論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定以及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無菌操作，如操作不慎引起污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可*，影響下一步工作的進(jìn)行。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1 培養(yǎng)基和菌種

淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基，活性污泥混合液。普通瓊脂斜面和平板,營養(yǎng)肉湯,普通瓊脂高層(直立柱)。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌。

2 溶液或試劑

10%酚液，盛9ml無菌水的試管，盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，4%水瓊脂。

3 儀器或其它用具

無菌玻璃涂棒，無菌吸管，接種環(huán)，無菌培養(yǎng)皿，鏈霉素和土樣，顯微鏡，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、涂布器等。酒精燈，玻璃鉛筆，火柴，試管架、接種環(huán)、接種針、接種鉤、滴管、移液管、三角型接種棒等接種工具。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、流程

倒平板→制備梯度稀釋液→涂布（或劃線法）→培養(yǎng)→挑單菌落→保存。

2、步驟

2.1稀釋涂布平板法

2.1.1 倒平板

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏I號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化待冷至55～60℃時(shí)，高氏I號瓊脂培養(yǎng)基中加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏培養(yǎng)中加入鏈霉素溶液(終濃度為30μg/ml)，混合均勻后分別倒平板，每種培養(yǎng)基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

2.1.2 制備活性污泥混合液稀釋液

稱取土樣l0g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細(xì)胞分散。用一支lml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀釋度的活性污泥混合液溶液，注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管。

2.1.3 涂布

將上述每種培養(yǎng)基的三個(gè)平板底面分別用記號筆寫上10-4、10-5和10-6三種稀度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5和10-6，從三管活性污泥混合液稀釋液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在對應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置。

用無菌玻璃涂棒，右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5～l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。

2.1.4 培養(yǎng)

將高氏I號培養(yǎng)基平板和馬丁氏培養(yǎng)基平板倒置于28℃溫室中培養(yǎng)3～5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)2～3d。

2.1.5 觀察并挑菌落

將培養(yǎng)后長出的單個(gè)菌落根據(jù)其大小、顏色、形狀等特征進(jìn)行觀察，之后根據(jù)菌落不同特征分別挑取少許細(xì)胞接種到上述三種培養(yǎng)基斜面上，分別置28℃和37℃溫室培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

2.2 平板劃線分離法

2.2.1 倒平板

按稀釋涂布平板法倒平板，并用記號筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、土樣編號和實(shí)驗(yàn)日期。

2.2.2 劃線

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述10-l的活性污泥混合液懸液一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無論采用哪種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。

用接種環(huán)以無菌操作挑取活性污泥混合液懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作**次平行劃線3～4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過**次劃線部分作**次平行劃線，再用同樣的方法通過**次劃線部分作第三次劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。