溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑,用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中DNA。溴化乙錠用標(biāo)準(zhǔn)302nm 紫外光透射儀激發(fā)并放射出橙紅色信號(hào),觀察瓊脂糖凝膠中DNA*常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色,溴化乙錠含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中,大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后,其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互用。這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近,導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光,其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料,而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下,被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍,所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠(0.5ug/ml)時(shí),可以檢測到少至10ng的NDA條帶。溴化乙錠可以嵌入堿基分子中,導(dǎo)致錯(cuò)配。
溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑,具有高致癌性!會(huì)在60-70度是蒸發(fā)(所以*好不要在膠太熱的時(shí)候加,或者應(yīng)該加到液體里,0.5ug/ml,染色半小時(shí))(當(dāng)EB加得過多時(shí),也可以在室溫用水將已染色的凝膠浸泡20min以降低未結(jié)合的EB引起的背景熒光)。
DEPC即二乙基焦碳酸酯(diethylprocarbonate),可滅活各種蛋白質(zhì),是RNA酶的強(qiáng)抑制劑。DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì),在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進(jìn)行,并避免接觸皮膚。DEPC毒性并不是很強(qiáng),但吸入的毒性是*強(qiáng)的,使用時(shí)戴口罩。不小心占到手上注意立即沖洗,RNase AwayTM試劑可以替代DEPC,操作簡單,價(jià)格低,且無毒性。只需將RNaseAwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面,浸泡后用水沖洗去除,即可以快速去除器皿表面的RNase,并且不會(huì)殘留而干擾后繼實(shí)驗(yàn)。
9. 氯仿(CHCl3)對(duì)皮膚、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激作用。它是一種致癌劑,可損害肝和腎。它也易揮發(fā),避免吸入揮發(fā)的氣體。操作時(shí)戴合適的手套和**眼鏡并始終在化學(xué)通風(fēng)櫥里進(jìn)行。
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