本方法有多種用途,主要包括:
從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段;
從DNA反應物中純化目的DNA片段,如回收純化PCR產(chǎn)物、酶切連接反應中的DNA片段;
從探針制備反應物中去除未標記上的核苷酸以及小的DNA片段(比如引物);
DNA濃縮、去鹽及去除雜質(zhì)。
本試劑盒的主要成分“基因純”試劑是無毒、無味、無腐蝕作用的白色顆粒,能專一性結(jié)合0.2kb到50kb大小的DNA(雙鏈或單鏈,線性、環(huán)狀或超螺旋),不結(jié)合RNA、蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸、有機溶劑、去污劑及其它可能抑制酶活性的有機或無機物。
一、使用本法回收DNA片段有以下優(yōu)點:
高純度:回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白質(zhì)及其它有機分子,可直接用于酶切、連接、探針制備、序列測定等;
簡便:所需主要儀器是一架臺式離心機;
快速:整個回收過程只需半個小時;
高效:回收得率達到70%以上;
多用途:可以同時作膠回收、PCR產(chǎn)物回收、DNA片段及探針的純化濃縮等;
**:不接觸苯酚、氯仿等有害物質(zhì)。
二、試劑盒組成
1.碘化鈉溶液: 50ml
2.DNA洗滌液(20倍濃縮液):10ml
3.“基因純”試劑: 1ml
4.超純水: 1ml
使用前,將DNA洗滌濃縮液(10ml)倒入一玻璃瓶中,加140ml無水乙醇及50ml蒸餾水(由使用者自配),混勻后置于-20℃冰箱中,其余溶液置于4℃冰箱。
三、操作步驟
從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段
a. 常規(guī)DNA電泳。按常規(guī)方法用溴化乙錠(EB)染色DNA,而后將欲分離的DNA帶從膠上切割下來,置于一1.5ml離心管中。
b. 稱出凝膠帶的重量,加入三倍量(V/W)的碘化鈉溶液。(如0.1g凝膠中加入0.3ml碘化鈉溶液)。
c. 置于55℃水浴5-10分鐘,直至凝膠完全溶化。
d. 加入20ul充分混勻的“基因純”試劑(建議使用前用漩渦振蕩器振蕩3分鐘),室溫放置5分鐘(期間不時將管子顛倒幾次以混勻)。
e. 離心10秒(10,000rpm),倒去上清液。
f. 加0.8ml剛從冰箱中取出的DNA洗滌液,充分搖勻,離心10秒,去上清。
g. 重復步驟f兩次(共洗滌三次)。
h. 用吸水紙仔細將管壁上及管底殘留的洗滌液吸干。
i. 加入20ul超純水,混勻后置于55℃水浴5分鐘。
j. 離心3分鐘,將上清液小心吸至另一個離心管,即為純化的DNA??芍苯佑糜诿盖小喛寺?、PCR、標記、探針制備、序列測定、細胞轉(zhuǎn)染等。
注意事項:
溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞,故盡量放置于暗室,切帶時應使用長波長紫外燈,切膠時間盡量短。
DNA洗滌液應保持在低溫,否則可能使DNA從“基因純”試劑上脫落而導致回收率降低。
步驟h是另一關(guān)鍵,管壁和管底殘留的洗滌液若不完全除去,可能導致“基因純”試劑上結(jié)合的DNA無法由蒸餾水洗脫。
PCR反應物中純化目的DNA片段
PCR反應完畢后,加蒸餾水至100ul(*后體積)。
加入300ul碘化鈉溶液,混勻。
以下步驟與“從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段”中步驟d到j相同。
從探針制備反應中除去未標記上的核苷酸及小的DNA片段
探針制備反應完畢后,加蒸餾水至100ul(*后體積)。
加入300ul碘化鈉溶液,混勻。
以下步驟與“從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段”中步驟d到j相同。
DNA濃縮,去鹽及去除雜質(zhì)
加入3倍量的碘化鈉溶液于樣品DNA溶液中(若DNA為固態(tài),則先將之溶于適量水或TE中,再加3倍體積的碘化鈉溶液)。
加20ul或更多的“基因純”試劑(每ul該試劑可吸附0.3ugDNA,操作者可根據(jù)這一指標自行決定“基因純”試劑的用量,但不應少于10ul)。
以下步驟與“從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段”中步驟d到j相同。
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