在不少生命科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中，我們都需用到寡核苷酸，因此，掌握寡核苷酸的技術(shù)對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)非常重要。本文集合了各個(gè)論壇里的兄弟姐妹對(duì)寡核苷酸相關(guān)實(shí)驗(yàn)和概念的經(jīng)典問題和回答，希望對(duì)大家的實(shí)驗(yàn)有所啟發(fā)。

Q1、*近看文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)了反義寡核苷酸、義寡核苷酸、錯(cuò)義寡核苷酸(無意義寡核苷酸)，我知道反義寡核苷酸技術(shù)，但是什么叫義寡核苷酸、錯(cuò)義寡核苷酸(無意義寡核苷酸)，查了一下沒有搞清楚，請(qǐng)各位老師幫忙解釋一下啊，非常感謝!

A1、舉個(gè)例子說明吧。

Stat3正義寡核苷酸序列：5’ AGAAACAGGATGGCCCAATGG 3’，即與原始DNA序列的正鏈;

Stat3反義寡核苷酸序列：5’ CCATTGGGCCATCCTGTTTCT 3’;即正鏈的反向互補(bǔ)序列;

Stat3錯(cuò)義寡核苷酸序列：5’ CCATTGCGCCATCGTGTTACT 3’;即將反義鏈個(gè)別或若干個(gè)堿基隨機(jī)改變，產(chǎn)生的新鏈，又叫scrambled strand.

Q2、在非變性的聚丙烯酰胺凝膠中，相同長(zhǎng)度的雙鏈和單鏈寡核苷酸遷移率那個(gè)快一些?有理論根據(jù)嗎?我使用12%的非變性的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)單鏈寡核苷酸以及互補(bǔ)單鏈核苷酸退火后的雙鏈寡核苷酸，發(fā)現(xiàn)雙鏈明顯較快。我該怎么說明一下這種現(xiàn)象?(探針用于EMSA)另外，雙鏈寡核苷酸形成構(gòu)象的機(jī)會(huì)大嗎?有沒有必須的*小長(zhǎng)度?

A2、我想知道你跑單鏈的時(shí)候怎么看到的顏色，如果能看到，也是單鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)了?對(duì)于這個(gè)問題，似乎要取決于此寡核苷酸的序列，如果單鏈就能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，而且穩(wěn)定，理論上講單鏈的應(yīng)該跑得快。而沒有二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以想象雙鏈中插入的EB較多，跑得比無EB會(huì)慢些，但結(jié)構(gòu)完整、封閉，也許會(huì)類似球形構(gòu)象(相對(duì)比無二級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈)，跑得快些。不過這都不是書本上可查得到的理論依據(jù)。

Q3、請(qǐng)教各位高手，

我年前做了部分原位雜交，用RNA探針，圖不漂亮。現(xiàn)在想用寡核苷酸探針做，有些問題請(qǐng)教各位!

1，寡核苷酸探針序列選擇需要注意事項(xiàng)。有沒有可以幫助設(shè)計(jì)探針的公司，大家覺得那家公司的探針合成和標(biāo)記比較過關(guān)，煩您推薦給我。

2，看到的文獻(xiàn)多是同時(shí)用三條探針進(jìn)行雜交，也有用5條探針的，請(qǐng)教各位用幾條比較好?

3，寡核苷酸探針*大的問題可能是非特異性的問題，請(qǐng)教各位怎樣增加特異性，減少非特異的產(chǎn)生???

A3、我不知道你要的探針多長(zhǎng)有什么特別要考慮的，若圖簡(jiǎn)單，不若合成一段(含T7promoter識(shí)別序列)，然后按照MAXIscript?T7 in vitro Transcription Kit.就可以做成RNA 探針了，應(yīng)該沒什么難得!(長(zhǎng)片斷的RNA探針我沒有經(jīng)驗(yàn))

Q4、各位大俠，我問一個(gè)菜鳥問題，我要在一個(gè)寡核苷酸的5’末端標(biāo)記上[gama-32P]ATP。分子克隆上說5‘末端要是帶[-OH]羥基。我直接從公司合成的寡核苷酸，不作任何處理，結(jié)果沒有標(biāo)記上。我問一下，直接從公司合成的寡核苷酸5’末端是帶什么基團(tuán)，是不是直接帶羥基[-OH]。謝謝!!另外利用T4寡核苷酸激酶使寡核苷酸5‘末端磷酸化制備放射性寡核苷酸探針需要有那些注意的事項(xiàng)，謝謝!!!

A4、如果不要求修飾，公司合成的OLIGO的5'端不會(huì)做任何修飾，可以直接用T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK)進(jìn)行5'磷酸化，當(dāng)然了磷酸化的效率受到很多因素影響。T4 PNK催化的核酸5'末端標(biāo)記反應(yīng)的效率受5'末端形狀的較強(qiáng)影響。一般效率按：?jiǎn)捂溎┒?ge;雙鏈5'突出末端>雙鏈平滑末端>雙鏈3'突出末端的順序降低。特別是由于雙鏈的缺口 (Gap) 及切口 (Nick) 部分的磷酸化非常困難，所以為了提高標(biāo)記效率需要使用高濃度、過量的ATP。另外，即使同為平滑末端，富含AT的末端標(biāo)記效率較高。

Q5、我想用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸，看相關(guān)文獻(xiàn)，其脂質(zhì)體的使用量和反義寡核苷酸的濃度設(shè)計(jì)區(qū)別很大，我想請(qǐng)教下，我用96孔板做，脂質(zhì)體的量以什么為宜啊，我轉(zhuǎn)染入的是癌細(xì)胞?；蛘哒f脂質(zhì)體與反義寡核苷酸的量以什么比例*好啊

A5、一般建議用無血清培養(yǎng)基稀釋，用量比是根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑的Protocol來，具體可以進(jìn)行換算

Q6、哪位大俠做過寡核苷酸探針的雜交?雜交溫度如何確定?寡核苷酸片斷大約18-20bp，謝謝請(qǐng)多指教

如果跟據(jù)Tm-5度來確定，是不是指的水溶液雜交?加了50%的甲酰氨又該如何估算?

有沒有必要做個(gè)dot blot來**雜交溫度?

A6、我覺得因改是4×(A+T)+2×(G+C)，再減去5度就行。寡核苷酸探針的雜交溫度不應(yīng)該遵循PCR產(chǎn)物探針的原則。

Q7、鏈寡核苷酸，全段時(shí)間跑出過帶，后來就又沒有帶了，不知道怎么回事。還有人跑過化學(xué)合成的miRNA么，想檢測(cè)下看看我的東西，怎么總是一點(diǎn)帶都沒有，不知道這種20個(gè)核苷酸的單鏈miRNA能不能用EB染色，還是量不夠?急，請(qǐng)大家?guī)兔?/div>